Лекция 10

Активированная хемилюминесценция и биолюминесценция как инструмент в медико-биологических исследованиях

Реферат (English)

Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, отличается низкой интенсивностью, что стало главным препятствием на пути к широкому ее использованию в аналитических целях. В присутствии определенных соединений, активаторов ХЛ, хемилюминесценция при реакциях активных форм кислорода и пероксидации липидов может быть усилена в тысячи и сотни тысяч раз. В основе биолюминесценции лежат химические превращения особых веществ (люциферинов) под действием специальных ферментов (люцифераз). Как хемилюминесценция, так и биолюминесценция находят широкое применение в аналитической биохимии, в частности, в клиническом биохимическом анализе.

Активированная хемилюминесценция

Собственная хемилюминесценция, сопровождающая биохимические реакции в клетках и тканях, обладает, как правило, очень низкой интенсивностью и не случайно получила название "сверхслабого свечения" [1]. Это оказалось главным и пока не преодоленным препятствием на пути к широкому использованию собственной хемилюминесценции в аналитических целях. Значительное распространение получило однако измерение хемилюминесценции в присутствии определенных соединений, получивших в отечественной литературе общее название "активаторов", а за рубежом – "усилителей" (enhancer) хемилюминесценции. По механизму действия активаторы распадаются на две четко различающиеся группы, которые можно соответственно назвать химическими и физическими активаторами [2]. Химические активаторы ХЛ – это соединения, вступающие в реакции с активными формами кислорода или органическими свободными радикалами, в ходе которых образуются молекулы продуктов в возбужденном электронном состоянии. Наблюдаемое при этом свечение связано с переходом молекул в основное состояние, что приводит к высвечиванию фотонов:

Активатор + радикалы -> продукт* -> продукт + фотон

Хорошо известными представителями таких активаторов могут служить люминол (3-аминофталевый гидразид) и люцигенин [Бис(N-метилакридиний)]. На рис.1 дана упрощенная схема превращений люминола в присутствии радикалов кислорода. Под действием окислителя, в нашем случае – радикала гидроксила, происходит образование радикала люминола, который затем вступает в реакцию с супероксидным радикалом, образуя внутреннюю перекись (диоксид). Ее разложение приводит к образованию возбужденной молекулы 3-аминофталата. Переход этой молекулы в основное состояние сопровождается испусканием кванта света. Физические активаторы не вступают в химические реакции и не влияют на ход реакций, сопровождающихся свечением, но, тем не менее, многократно усиливают интенсивность хемилюминесценции. В основе их действия лежит физический процесс переноса (миграции) энергии с молекулы продукта хемилюминесцентной реакции на активатор:

Радикалы -> продукт* -> продукт + фотон 1

(неактивированная ХЛ)

Продукт* + активатор -> продукт + активатор* -> фотон 2

(активированная ХЛ)

Интенсивность свечения в большой степени зависит от квантового выхода люминесценции продукта реакции, т.е. от того, какая часть возбужденных молекул продукта перейдет в основное, невозбужденное состояние с испусканием фотона. Обычно эта доля невелика, всего десятые или даже сотые доли процента. Но если все молекулы продукта передадут энергию электронного возбуждения на молекулам активатора, то интенсивность свечения будет теперь определяться уже квантовым выходом люминесценции активатора, который в идеале приближается к единице. (Подробнее с этим вопросом можно ознакомиться в соответствующих руководствах, например [3]). К физическим активаторам можно отнести некоторые люминесцирующие соединения, усиливающие ХЛ при цепном окислении липидов. Измерение этой хемилюминесценции пока еще не стало рутинным лабораторным методом в значительной мере из-за ее низкой интенсивности. Поэтому ведется поиск веществ, усиливающих "липидную" ХЛ. Оказалось, что некоторые красители и комплексы редкоземельных элементов обладают способностью многократно усиливать интенсивность такой хемилюминесценции. Так, например, комплекс редкоземельного иона европия (Eu3+) с антибиотиком хлортетрациклином усиливает ХЛ при окислении липидов почти в 1000 раз. Один из красителей, производное кумарина, применяемое при создании лазеров под условным названием С-525, усиливает хемилюминесценцию, сопровождающую цепное окисление липидов, более чем в 1500 раз, никак не влияя при этом на ХЛ при взаимодействии радикалов кислорода (гидроксила и супероксида). Формула этого вещества приведена на рис.2. Активируют свечение (правда, в меньшей степени) и такие известные красители как родамин Ж6, нильский красный и нильский синий, а также некоторые порфирины. Все эти активаторы не оказывают влияния на ход реакций перекисного окисления, но заметно увеличивают интенсивность свечения. По-видимому, в основе их действия лежит физический процесс процесса переноса (миграции) энергии с молекулы продукта хемилюминесцентной реакции (например, кетона) на активатор:

LOO· + LOO· -> LOH + L=O* + O₂

L=O* -> L=O + hn₁ (слабое свечение; j = 10^-4)

L=O* + А -> L=O + А* (перенос энергии)

А* -> А + hn_A (яркое свечение; j = 10^-2 - 10^-1)

Интенсивность свечения в присутствии активатора во много раз выше, чем без него, по той причине, что квантовый выход j люминесценции активатора (А) выше квантового выхода люминесценции продукта реакции (Р). Было также показано, что спектр активированной хемилюминесценции в изученных случаях был сходен со спектром фотолюминесценции активатора, т.е. его люминесценции при освещении ультрафиолетовыми лучами.

Использование активированной ХЛ в биохимических анализах

Обнаружение катализаторов, разлагающих перекись водорода с образованием свободных радикалов

Чистая перекись водорода с люминолом реагирует вяло, и хемилюминесценция при этом не наблюдается. Если перекись водорода разлагается ферментативным путем, например, при действии каталазы, свободные радикалы не образуются и свечение также не возникает. В присутствии ионов металлов переменной валентности, таких как железо, медь или марганец, а также некоторых их комплексов, например, производных гема, перекись водорода разлагается с образованием радикалов (гидроксила и супероксида) и возникает яркое свечение, связанное с реакциями люминола. По этой причине хемилюминесценция в присутствии люминола часто используется для определения в биологических средах малых количеств геминовых соединений, металлов переменной валентности, а также вообще способности биологического материала разлагать перекись водорода. Приведем два примера. У больных инфарктом миокарда в моче могут появиться очень небольшие количества миоглобина. Гем-содержащие соединения, к которым относится миоглобин, дают очень яркое свечение в присутствии перекиси водорода и люминола в сильно щелочной среде. Свечение мочи в этих условиях может служить одним из показателей инфаркта у больного (Барон, 1985, цит. По [1]). На поверхности свежей раны выделяется жидкость, называемая раневым экссудатом. В ней содержится каталаза – фермент, разлагающий перекись водорода без образования свободных радикалов. Наряду с этим жидкость содержит другие гем-содержащие белки и ионы железа, которые катализируют разложение перекиси водорода с образованием свободных радикалов кислорода, токсичных для клеток окружающей ткани. При добавлении к раневому экссудату перекиси водорода с люминолом наблюдается хемилюминесценция, тем более сильная, чем больше радикалов образуется при разложении перекиси. Таким образом, хемилюминесценция показывает, сколько токсичных радикалов образуется в экссудате. В свежей ране таких радикалов много, а по мере заживления их становится все меньше и меньшее. Ускорение заживления ран за счет применения лекарственных средств или облучения светом лазера сопровождается соответственным снижением хемилюминесценции экссудата. Таким образом, этот метод позволяет врачу контролировать эффективность лечения и вносить коррективы в сроки и дозы применения лечебных процедур [4].

Люминесценция фагоцитов

В рассмотренных случаях радикалы кислорода образовывались при разложении перекиси водорода, добавленной экспериментатором. Но живые клетки – фагоциты (к которым относятся гранулоциты и моноциты крови, а также тканевые макрофаги) сами образуют активные формы кислорода при их стимулировании. При этом наблюдается хемилюминесценция, особенно яркая в присутствии люминола (или люцигенина). На рис.3 (А) в качестве примера показана хемилюминесценция клеток крови при действии на кровь кратковременных электрических импульсов, вызывающих увеличение проницаемости клеточных мембран и стимуляцию выделения клетками активных форм кислорода. Такие же "хемилюминесцентные ответы" можно получить, если добавить к лейкоцитам крови суспензию бактерий, изолированные оболочки дрожжевых клеток, кристаллы кварца или сульфата бария, а также определенные химические соединения; все эти агенты получили собирательное название "стимулов". Стимулированная ХЛ клеток в присутствии люминола – ценный показатель функционального состояния фагоцитов крови и тканей, их способности производить при необходимости активные формы кислорода, т.е. выполнять свою защитную функцию. Эта способность обычно усиливается при возникновении в организме очагов воспаления (например, после инфаркта миокарда) и в ряде других случаев. Наоборот, при длительном недостатке кислорода, связанном с общим ослаблением организма, активность фагоцитов и ХЛ-ответы снижаются. Два результата таких исследований даны в качестве примера на рис.3 (Б) и 4. Как видно на рис.3 (Б) у больных семейной гиперхолестеринемией (при этой наследственной болезни в крови содержится очень много холестерина и имеется выраженная предрасположенность к раннему развитию атеросклероза) ХЛ ответ клеток на стимул почти в четыре раза превышает ответ клеток здоровых доноров. Назначенное лечение – облучение крови ультрафиолетовым светом (УФ-ОК) оказалось малоэффективным, если верить данному показателю. В Институте Физико-химической медицины М. П. Шерстневым было проведено обследование большой группы больных различными заболеваниями (рис.4). При затяжных хронических заболеваниях свечение клеток снижалось, тогда как при возникновении или обострении воспалительного процесса у больных происходило резкое увеличение активности клеток-фагоцитов. Так встречает организм инфекционную опасность – усиливается способность фагоцитов выделять активные формы кислорода для борьбы с чужеродными микроорганизмами. Хотя люминесценция люминола – весьма чувствительный метод обнаружения радикалов кислорода, метод не очень специфичен. Свечение наблюдается при действии на люминол не только радикалов гидроксила, но и при действии гипохлорита и ряда других окислителей. Заметный вклад в ХЛ-ответ клеток вносит выделение окиси азота: ингибитор NO-синтазы (фермента катализирующего образование окиси азота в клетках) уменьшает свечение почти вдвое. Большей избирательностью отличается люцигенин, свечение которого происходит при восстановлении красителя супероксидными радикалами. Это соединение часто используется для изучения образования супероксидных радикалов различными клетками и при биохимических реакциях "в пробирке".

Хемилюминесцентный иммунный анализ

По идеологии хемилюминесцентный иммунный анализ не отличается от радиоиммунного, с той только разницей, что вместо радиоактивно-меченнных субстратов или антител используются субстраты и антитела, "меченнные" соединением, которое вступает в реакции, сопровождающиеся хемилюминесценцией, в присутствии перекиси водорода и катализатора (обычно это фермент пероксидаза). Хемилюминесцентной меткой (ХЛ-меткой) чаще всего служат низкомолекулярные соединения, по химической структуре близкие люминолу и люцигенину, такие как изолюминол, сукцинилированный люминол, эфиры акридиния и другие. Присоединение хемилюминесцентной метки производится либо к антигену, т.е. низкомолекулярному соединению либо к антителу на этот антиген. В первом случае метод называется CIA (Chemiluminescent Immuno Assay), во втором - ICMA (ImmunoChemiluminoMetric Assay). По-русски это соответствовало бы ХИА (Хемилюминесцентный Иммунный Анализ) и ИХМА (Иммуно-ХемилюминоМетрический Анализ). Оба метода направлены на определение биологически-важных низкомолекулярных соединений (например, гормонов) в тех концентрациях (как правило, очень низких), в которых они встречаются в биологических объектах. При использовании метода CIA (см. рис.5, А) к раствору, содержащему интересующее нас анализируемое соединение (обозначим его как A) добавляют определенное количество того же, но ХЛ-меченнного соединения (обозначим его как A*) и антитела (анти-А). Образуется смесь меченнных и немеченнных иммунных комплексов (A-анти-A и A*-анти-А, соответственно):

A + A* + анти-A -> A-анти-A + A*-анти-A

Очень важно, что пропорция между меченнным и немеченным иммунными комплексами зависит от того, сколько меченного антигена мы добавили (A*) и сколько немеченного было в исследуемой пробе (A), а именно: чем больше было немеченного антигена, тем меньше доля меченных антител. Теперь остается очистить смесь иммунных комплексов и определить количество A*-анти-А по хемилюминесценции. Интенсивность ХЛ будет тем меньше, чем больше было немеченных антигена A (т.е. анализируемого вещества) в исследуемой пробе. Чтобы анализ был количественным, предварительно строят калибровочную кривую, т.е. измеряют зависимость интенсивности ХЛ в конечной пробе от концентрации стандартного раствора изучаемого вещества A. Затем измеряют интенсивность ХЛ в растворе с неизвестной концентрацией антигена (A), повторяя те же процедуры, и по калибровочной кривой находят концентрацию A. При использовании метода ICMA (рис.5, Б) берут избыток ХЛ-меченнного антигена (анти-А*) и добавляют к нему раствор с изучаемым веществом (A). Образуется ХЛ-меченнный иммунный комплекс:

A + анти-A* -> A-анти-A*

Остается отделить иммунные комплексы от других участников реакции и измерить интенсивность ХЛ. В данном случае она будет тем выше, чем меньше было анализируемого вещества A в пробе. Для количественного анализа и здесь предварительно строят калибровочную кривую. В обоих методах одна из практических трудностей – это очистка иммунных комплексов. Она решается также методами иммунохимии. Детали этой техники мы здесь рассматривать не будем, но один из подходов заключается, например, в использовании порошка сорбента (см. рис.5, В), к поверхности которого "пришиты" (т.е. присоединены ковалентной химической связью) антитела к анти-А (назовем их анти-анти-А). В присутствии растворенных комплексов (А-анти-А и/или А*-анти-А) образуется тройной комплекс ("сандвич"): (анти-анти-А)-(анти-А)-А и/или (анти-анти-А)-(анти-А)-А*. Адсорбент можно осадить и затем определить в осадке (после дополнительных обработок) количество меченного антигена.

Биолюминесценция

Биолюминесценция (БЛ) – это свечение живых организмов, видимое простым глазом. Способностью к БЛ обладают организмы, принадлежащие к самым разным систематическим группам: бактериям, грибам, моллюскам, насекомым. Механизм реакций, сопровождающихся свечением, весьма различен у разных видов; однако обычно включает в себя химическое превращение определенного низкомолекулярного субстрата, называемого люциферином, катализируемое ферментом, называемым люциферазой.

Биолюминесценция светляка

Всем известное свечение светлячков происходит в результате биохимической реакции окисления светлячкового люциферина кислородом воздуха в присутствии аденозинтрифосфорной кислоты (ATP):

Здесь AMP – аденозинмонофосфат, PP – пирофосфат, E – люцифераза, LH₂ – люциферин, P* и P – продукт реакции (оксилюциферин) в возбужденном и основном состояниях, соответственно. В отсутствие АТФ биолюминесценция не наблюдается; на этом основан один из самых чувствительных методов анализа АТФ в различных объектах. Для определения содержания АТФ смотрят хемилюминесценцию в изучаемом растворе, к которому добавляют смесь люциферина и люциферазы, выделенных из светлячков либо полученных синтетически и методом генной инженерии. Удается определять содержание АТФ в образце от 10^-17 моля и выше. Поскольку биосинтез АТФ — показатель нормальной жизнедеятельности клеток, препарат люциферин — люцифераза светляка используют для обнаружения бактериального заражения в какой-либо среде, оценки жизнеспособности эритроцитов при консервировании крови, изучения действия на микроорганизмы антибиотиков и т. д. В последнее время используют препараты иммобилизованной люциферазы (т.е. фермента, молекулы которого химически связаны с полимерной пленкой), стабильность которой выше; такой препарат можно использовать многократно.

Биолюминесценция медузы Aequorea

В последнее время для обнаружения малых количеств ионов кальция широко используется хемилюминесценция белка, выделенного из медузы Aequorea. Этот фотопротеин, называемый экворином, содержит в себе ковалентно связанный люциферин, который в присутствии ионов Ca²⁺ подвергается химическим превращениям с образованием продукта в возбужденном электронном состоянии. Вследствие малой инерционности и высокой чувствительности биолюминесцентный метод весьма эффективен при изучении высвобождения и связывания Ca²⁺ в биологических системах, например, во время мышечного сокращения. При этом экворин добавляют прямо к изучаемому объекту и по интенсивности биолюминесценции следят за динамикой изменения содержания свободного кальция.

Биолюминесценция светящихся бактерий

К числу светящихся относится немного видов бактерий. Хемилюминесцентная реакция, непосредственно сопровождаемая свечением, катализируется ферментом — бактериальной люциферазой и включает в себя процессы окисления восстановленного флавинмононуклеотида ФМН-H₂ до ФМН и одновременно – алифатического (C₁₄) альдегида до миристиновой (C₁₄) кислоты. Эта реакция протекает, по-видимому, через стадию образования пероксида флавинмононуклеотида.

Здесь E – люцифераза, -OOH – гидроперекисная группа, RCOOH - алифатический альдегид, RCOOH – жирная кислота, образующаяся при окислении альдегида. В последние годы получают все большее распространение биохимические анализы, в которых в качестве тест-объекта используют целые бактериальные клетки (в суспензии), экстракты светящихся бактерий, изолированный фермент – люциферазу. Прежде всего, измерение биолюминесценции бактерий можно использовать для определения низких концентраций кислорода. Дело в том, что в отсутствие кислорода фотобактерии не обладают свечением, свечение усиливается пропорционально концентрации кислорода в среде в интервале концентраций O₂ от 2·10^-8 до 5·10^-6 моль/л. Можно использовать светящиеся бактерии и в качестве "лабораторного животного", т.е. живых организмов, на которых изучают, к примеру, действие различных токсических веществ. Светящиеся бактерии весьма чувствительны к примесям токсических веществ в воде, и измерение биолюминесценции можно использовать для оценки загрязнения воды токсическими соединениями, скажем ионами тяжелых металлов. С другой стороны, свечение бактерий можно использовать для предварительной оценки эффективности новых антибиотиков. Но наиболее перспективно, несомненно, применение очищенных препаратов бактериальной люциферазы. Фермент, очищенный от примесей низкомолекулярных соединений, обладает способностью к излучению света лишь в присутствии всех трех субстратов: кислорода, ФМН-H₂ и длинноцепочечного альдегида (с длиной цепи не менее 8 углеродных атомов). Добавив к изолированной бактериальной люциферазе ФМН-H₂, исследователь получает высокочувствительную систему для определения алифатических альдегидов; к их числу принадлежат, в частности, половые гормоны насекомых, феромоны, которые обнаруживаются в количестве 10^-14 моль, что позволяет изучать метаболизм этих веществ у одной особи. В медицине обещает найти широкое применение анализ содержания ФМН и ФАД, основанный на биолюминесцентном определении ФМН-H₂, образующегося при их предварительном восстановлению. Наиболее широкое применение в биохимических и клинических лабораторных анализах обещает получить препарат, состоящий из смеси двух компонентов (ферментов): бактериальной люциферазы и НАДН:ФМН-оксидоредуктазы. В отечественном наборе КРАБ (комплект реактивов для анализа биолюминесценции) содержатся люцифераза и оксидоредуктаза, выделенные из биомассы светящихся бактерий. Добавив к препарату в присутствии C₁₅-альдегида НАДН, получается высокочувствительный реактив для определения ФМН (без его предварительного восстановления):

Наоборот, если добавить к смеси люциферазы и оксидоредуктазы альдегид и ФМН, то такая смесь может использоваться как биолюминесцентная тест-система для количественного определения НАДН в биологических материалах (схема реакций такая же). Удлиняя цепочку биохимических стадий, предшествующих биолюминесценции, можно получить все новые аналитические возможности. Для определения активности ферментов дегидрогеназ или (альтернативно) для определения концентрации субстратов этих ферментов используется следующая тест-система:

Люцифераза + Оксидоредуктаза + Альдегид + ФМН + НАД⁺

В присутствии субстрата какой-либо дегидрогеназы, например, в присутствии лактата, можно определять по биолюминесценции активность соответствующей дегидрогеназы (в нашем примере активность ЛДГ, лактатдегидрогеназы):

и далее по схеме, приведенной выше. В присутствии изолированной дегидрогеназы можно определять концентрацию субстрата этого фермента в интересующей нас химической или биохимической системе (схема реакций та же).

Заключение

Подобно многим другим разделам науки, хемилюминесценция и биолюминесценция вначале были объектом исследования, а потом стали методом исследования других объектов. На сегодняшний день химические и физические явления, лежащие в основе чудесного превращения энергии биохимических реакций в световое излучение, в основном расшифрованы. Началось более или менее широкое использование хеми- и биолюминесценции в биохимических лабораторных и клинических исследованиях. Создаются серийные приборы – хемилюминометры и биолюминометры, выпускаются наборы реактивов для анализа определенных антигенов, антител и ферментов в крови больных и в других биологических жидкостях. Ведется поиск новых соединений, обладающих способностью вступать в химические реакции, сопровождающиеся свечением, с химически-активными продуктами жизнедеятельности живых клеток, такими как свободные радикалы и пероксиды (химические активаторы ХЛ), равно как и веществ, усиливающих квантовый выход хемилюминесценции (физические активаторы ХЛ). Одновременно с этим расширяется применение в аналитических целей методов биолюминесценции. Прогресс органической химии, молекулярной биологии и биотехнологии избавил нас от необходимости путешествовать на юг, чтобы ловить по ночам светляков, или охотиться в океане за медузами, чтобы выделить из живых существ фермент люциферазу и субстрат биолюминесцентных реакций – люциферин: люциферины научились синтезировать, а многие люциферазы можно получить сейчас методами генной инженерии. Короче говоря, применение методов хеми- и биолюминесценции, безусловно, поможет пролить свет на многие загадки, еще не решенные учеными.

Вопросы для самоконтроля

Применение хемилюминесценции, сопровождающей цепное окисление липидов, в медико-биологических исследованиях.

Активированная хемилюминесценция и биолюминесценция как инструмент в медико-биологических исследованиях

Реферат (English)