Этиотропное и патогенетическое лечение, профилактика


Оглавление

ТЕОРИИ КАМНЕОБРАЗОВАНИЯ -> Этиологическая и патогенетическая роль нанобактерий при МКБ

Этиологическая и патогенетическая роль нанобактерий при МКБ


    Нанобактерии (НБ) играют важную роль в развитии уролитиаза. Особенностью данных микроорганизмов является способность формировать очаги кристаллизации кальция фосфата с образованием минералов и повреждением уротелия собирательных трубочек и почечных сосочков.

    Нанобактерия, названная так в соответствии с ее малыми размерами, впервые была обнаружена в 1988 году геологом Техасского университета Робертом Фольком при исследованиях минералов горячих сернистых источ-ников в окрестностях Рима [5, 68]. С использованием электронной микроскопии

    Р. Фольк исследовал "картину" обнаруженных бактерий овоидной и призматической формы, размножающихся среди неорганического мира. НБ оказались покрыты оболочкой карбонатного апатита - своеобразной средой обитания, благодаря которой микроорганизм не только защищен от влияния окружающей среды, но длительное время был недоступен для бактериологических исследований. Финский биолог Олави Кайандер, работавший с клеточными культурами, неожиданно столкнулся с серьезной проблемой - выращиваемая им культура, часто переставала расти и погибала. При этом внутри гибнущих клеток О. Кайандер установил существование необычных "пузырьков" в несколько долей микрон. При выяснении причин апоптоза Кайандер обнаружил в фильтрате культуры странную бациллу, размеры которой колебались от 0,2 - 0,5 до 2 микрон, заключенную в каменную скорлупу [36, 52, 83, 84]. Этой бациллой оказалась нанобактерия (рис.6, 7).

    Электронная микрофотография двух минерализованных образований около 2-х микрометров в диаметре, названных - нанобактерия

    Рис.6. Электронная микрофотография двух минерализованных образований около 2-х микрометров в диаметре, названных - нанобактерия

    Нанобактерия, покрытая кристаллами апатита в стадии деления

    Рис.7. Нанобактерия, покрытая кристаллами апатита в стадии деления

    В 1996 году Р. Фольк и О. Кайандер обнаружили присутствие окаменевшей НБ на марсианском метеорите, залетевшем на Землю более двух миллионов лет назад, что послужило основанием для пересмотра существующих теорий о происхождении жизни на нашей планете и признания НБ в качестве "космического начала" органической жизни на Земле.

    НБ были обнаружены и как загрязняющие агенты клеточных культур. Стандартные микробиологические методы были неэффективны для выявления этих микроорганизмов, поскольку последние, как оказалось, размножаются в культуре клеток и не растут на стандартных питательных средах. Позже выяснилось, что НБ растут на средах DMEM или RPMI-1640, не нуждаясь в сывороточных добавках для роста. Характерной особенностью НБ оказалось их размножение внутри сформированных тонких полостей из апатитного слоя. В старых культурах при исследовании с помощью электронной микроскопии выявляются колонии НБ с минерализованными стенками в виде блоков (конгломератов), состоящих преимущественно из карбонатного апатита [51, 53, 54, 55]. Эти конгломераты могут увеличиваться в размере, давать отсевы, соединяться вместе, формируя камни, видимые невооруженным глазом. Рост минерала имеет место в виде концентрированных слоев нанокристаллов апатита с прерыванием в виде пористых структур (рис 8).

    Нанобактерия, обнаруженная внутри частично растворенного почечного камня

    Рис. 8. Нанобактерия, обнаруженная внутри частично растворенного почечного камня.

    Частота обнаружения НБ колеблется в широких пределах. К примеру, определено наличие НБ-антигена в сыворотке крови у примерно 5 % взрослых финнов. Выявлено, что около 14 % здоровых доноров в Швеции имеют антитела к этому агенту. Более того, препараты гамма-глобулина, приготовленные из плазмы тысячи здоровых добровольцев, содержат НБ-антитела. При некоторых заболеваниях, таких как атеросклероз или состояниях, требующих проведения гемодиализа, НБ-антитела и НБ-антигены могут быть обнаружены в крови или моче в большинстве случаев.

    Последующие исследования выявили, что примерно 80 % сывороток, выпускаемых различными фармакологическими компаниями, позитивно в отношении НБ и в них имеется рост минералобразующих агентов, имеющих диаметр от 80 нм до 500 нм, как и на дентальных отложениях. Нанобактерии были обнаружены у большого количества людей в сыворотке и в моче. Согласно различным данным НБ были изолированы из сыворотки крови, мочи, мочевых камней, дентальных камней и ряда мягких тканей. НБ хорошо размножаются в искусственной моче. Апатитные образования в почечных камнях и культуре нанобактерий имеют очень похожее строение (рис. 9).

    НАНОБАКТЕРИИ ПОЧЕЧНЫЕ КАМНИ
    НАНОБАКТЕРИИ ПОЧЕЧНЫЕ КАМНИ

    Рис. 9. Апатитные образования в почечных камнях и культуре нанобактерий

    Общая характеристика НБ по результатам исследования стандарта "strain" (SeraLab 901045) представлена в таблице 5.

    Таблица 5 - Общая характеристика нанобактерий.

    Морфология

    - Грам-негативные, фильтрующиеся (размер пор 0,22 мкм), бактериоподобные частицы с различным количеством покрытия из карбонатного апатита.

    - Размер единичных НБ колеблется от 80 нм до 500 нм.

    - НБ локализуются в центральной полости, окруженной апатитными отложениями. В среде с низким содержанием питательных веществ НБ имеют тенденцию формировать колонии, окруженные тонким покрытием кальция апатитом; кальцифицированные колонии могут достигать размеров более 1 мм.

    - Остаются жизнеспособными при температуре 90 0С в течение одного часа, устойчивы к дозе радиации 15 кГр и 5 % раствору NaCl

    Рост и метаболизм

    - Сывороточные формы размножаются около 3 дней.

    - Свободные сывороточные формы удваивают свою популяцию каждые 6 дней.

    - Метаболизм в 10 000 раз медленнее, чем у E. coli.

    - Инкорпорируют уредин и метионин в ДНК и белок, соответственно.

    - Лучше растут в аэробных условиях(5 % СО2 и 95 % воздуха).

    - Рост НБ подавляют ингибиторы синтеза нуклеиновых кислот (5-фторурацил, цитозина арабинозид и др., а также тетрациклин при терапевтической концентрации в сыворотке крови, триметоприм, сульфаметоксазол, нитрофурантоин, ампициллин и аминогликозиды).

    - in vitro рост НБ ингибирует цитрат и бисфосфонаты.

    Структура

    - НБ содержат более 30 протеинов.

    - Главным компонентом бактериальных пептидогликанов является мурамициновая кислота.

    Определение - Моноклональные антитела к белкам и пептидогликанам НБ, а также моноклональные антитела к хламидийным липополисахаридам позволяют распознавать интактные НБ.
    Клеточные эффекты

    - Некоторые изоляты НБ проявляют цитотоксичность на клетки млекопитающих in vitro, проникая внутрь путем эндоцитоза.

    - В эксперименте на мышах доказано, что внутривенное введение НБ приводит к экскреции их в мочу.

    Одним из важных методов обнаружения НБ является электронная трансмиссивная микроскопия, позволяющая выявлять НБ в виде темных частиц вследствие покрытия апатитом. Наличие НБ может быть выявлено после обработки 2 %-ным уранил ацетатом. Наибольший процент положительных находок отмечается при микроскопии после инкубации с коллоидным золотом, покрытым анти-НБ антителами с последующим отмыванием и высушиванием. Антитела определяются как тонкое покрытие на поверхности НБ. Поскольку НБ имеют покрытие из апатита как структурный компонент, который делает их видимыми, нет необходимости в фиксации перед электронной микроскопией. Теория НБ-зависимого формирования камней основывается на обнаружении НБ в почечных камнях, обнаружении подобных форм нанобактерий в культуре из почечных камней, формировании кальциевых камней нанобактериями in vitro в почках после НБ-инъекции в почки кролика. НБ способны продуцировать камнеобразующие колонии, содержащие интра- и экстрацеллюлярные кальциевые депозиты, повреждая клетки и различные клеточные культуры. Важным является дозозависимое формирование почечных камней, которое наблюдается через 1 месяц после инъекции НБ в почку кролика транслюмбальной чрезкожной пункцией. На экспериментальных животных показано формирование камней после введения НБ в почку, а сами НБ признаны нефротропными. У НБ обнаружена способность к адгезии, инвазии и повреждению клеток собирательных трубочек и зоны сосочков почек. Предположение о вовлечении НБ в формирование почечных камней подтверждает наблюдения Carr и Randall (рис.10).

    Различные типы тканевых преципитатов в почке

    Рис. 10. Различные типы тканевых преципитатов в почке.

    Фрагменты, описанные Carr, в почечных лимфатических протоках и собирательных трубочках были в виде маленьких отполированных депозитов кальция фосфата [47]. Кальция фосфат индуцировал формирование гетерогенной нуклеации кальция оксалата в зоне собирательных трубочек и ниже, являясь фактором риска образования "бляшек Рандалла". Randall описал кальций-содержащие бляшки в почечных сосочках и согласно его гипотезе формирование почечных камней начинается с этих бляшек вследствие формирования первичных тканевых повреждений [107]. Эксперименты с клеточными культурами выявили активные процессы вовлечения кристаллов кальция оксалата в клетки культуры, и этот процесс является активным и очень важным для формирования камней.

    Множество почечных камней имеет внутренний сфероид, состоящий из апатита. НБ, выделенные из сфероидных частиц, состоящих из апатита в условиях in vitro формируют частицы с подобной архитектоникой. Крошечные нанокристаллы имеют высокоорганизованную структуру подобную наносферической, обнаруживаемой в жемчуге и других кальций карбонатных образованиях в живых организмах, что предполагает протеиноопосредованный механизм минерального роста. С помощью уранилацетатной пробы установлено, что процесс биоминерализации НБ имеет место внутри слизисто-белкового матрикса, окружающего НБ. Следовательно, нанокристаллы апатита формируются на слизисто-белковой поверхности НБ. Кристаллурия приводит к образованию мочевых ионных конгломератов у камнеобразователей вследствие наличия активных очагов патологической кристаллизации или слабости ингибиторов кристаллизации. НБ транспортируют очаги кристаллизации апатита из крови в почечную ткань и мочу, и их активная роль в кристаллизации может объяснять выше наблюдаемые процессы [87].

    Биоминерализация - это специфический процесс. Формирование апатита in vitro останавливается только тогда, когда уровень кальция снижается до 50 % (с 1,8 ммоль до 0,9 ммоль) и уровень фосфата падает, примерно, до нуля. Присутствующие НБ могут использовать доломит как источник кальция для образования апатита и продолжения процесса биоминерализации. НБ-индуцированная биоминерализация является кислородозависимым процессом [57, 81, 82]. Гамма-излучение, в дозах предупреждающих репликацию НБ, прекращает и биоминерализацию. Процесс биоминерализации подавляется некоторыми антибиотиками и антиметаболитами, которые имеют нанобактерицидный эффект в терапевтических концентрациях. Свет низкой интенсивности (без термического эффекта), наоборот, стимулирует репликацию НБ и формирование камней из апатита. Наличие минерального комплекса макромолекулярного кальция фосфата вызывает не только кальцификацию в почках, но и в кровеносных сосудах с формированием атеросклероза. Введение ингибиторов белковой кальцификации этидроната способствует исчезновению протеинминерального комплекса через 24 часа после инъекции препарата. Таким образом, ингибирование костной минерализации этидронатом свидетельствует, что происхождение высокомолекулярного минерально-белкового комплекса содержащего фосфат кальция в сыворотке обусловлено НБ. Предполагается, что лечение бисфосфонатами, хелатными агентами или некоторыми антибиотиками приводит к элиминации или разрушению этих комплексов. Бисфосфонаты и хелатные агенты, как по отдельности, так и вместе с антибиотиками, могут быть полезны как для лечения патологической кальцификации у пациентов, формирующих камни, так и при атеросклерозе.

    Диагностика НБ методом анализа ДНК затруднена из-за невозможности изоляции нуклеиновых кислот, вследствие апатитного покрытия [98].

    Несмотря на противоречивость различных публикаций, являются ли НБ аутокатализаторами минеральных агрегатов или саморазмножающимися биологическими частицами, их следует рассматривать как инфекционные агенты, которые могут быть вовлечены в патологические процессы кальцификации.

    Таким образом, в настоящее время достаточно данных, чтобы считать НБ ренотропными, вызывающими нуклеацию и рост кристаллов апатита, инициируя почечную патологию путем повреждения тубулярного эпителия, биоминерализацией и, возможно, тубулярной обструкцией и хронической инфекцией, которая в результате приводит к нарушению тканевой репарации и формированию камня.

    В наших собственных исследованиях были изучены на наличие нанобактерий почечные камни (n=16), извлеченные из полостной системы путём открытых оперативных вмешательств. Предварительное рентгенологическое исследование выявило рентгеноконтрастность всех камней, что свидетельствовало о наличии солей кальция в их структуре. Затем камни были измельчены и растворены в 1М растворе соляной кислоты. После нейтрализации кислоты эквивалентным количеством 1M гидроксида натрия проведено кратковременное центрифугирование (30 с - 3000 оборотов) для осаждения крупных, нерастворившихся частиц, перенос надосадочной жидкости в другие пробирки и повторное центрифугирование (3000 оборотов) в течение 15 минут. После декантации осадок подвергли микроскопии для определения типа образующихся кристаллов. Его наносили на предметное стекло и после высушивания фиксировали 96 % этиловым спиртом. После фиксации и просушивания мазков наносили моноклональные антитела к хламидиям ("Хламискан", Россия) и стекла помещали во влажную камеру на 25 минут. По истечении указанного времени методом прямой иммуннофлюоресценции определяли наличие НБ. Интенсивность флюоресценции выражали знаком "плюс", отражая разницу в количестве флюоресцирующих точек в отдельных пробах. Результаты исследований представлены в таблице 6.

    Таблица 6 - Интенсивность флюоресценции растворенных почечных камней

    Проба
    1
    2
    3
    4
    5
    6
    7
    8
    9
    10
    11
    12
    13
    14
    15
    16
    Интенсивность флюоресценции
    ++
    +
    +
    +++
    ++
    +++
    +++
    +++
    +
    +++
    ++
    +++
    +
    +++
    +++
    +++
    Кристаллы солей
    ф
    о
    ф
    у
    у
    ф
    у
    ф
    ф
    у
    ф
    о
    у
    ф
    у
    ф

    Примечание: ф- фосфаты, у- ураты, о-оксалаты

    Учитывая наличие нанобактерий во всех исследованных почечных камнях, после удаления последних показано антибактериальное лечение, направленное на эрадикацию НБ из мочевыводящих органов и предупреждение, тем самым, рецидивов камнеобразования:

    1. Доксициклин (Юнидокс) по 0, 1 г дважды в день в течение 10 - 15 дней;
    2. Нитрофурантоин по 100 - 150 мг 3 - 4 раза в день в течение 5 - 8 дней;
    3. Цитратные смеси - Блемарен, Уралит, Уроцит, Полицитра в течение месяца под контролем рН мочи в 2 - 3 приема в течение суток;
    4. Бисфосфонаты (таблица 7).

    Таблица 7 - Современные бисфосфонаты, разрешенные к применению [26]

    Международное название Торговое название Показание к применению
    Этидронат Ксидифон, Плеостат Гиперкальциемия при неопласти-ческих процессах
    Клодронат (Clodronic acid) Бонефос Резорбция костной ткани, гиперкальциемия, возникающая вследствие малигнизации
    Памидронат Аредиа Метастазы злокачественных опухолей в кости
    Алендронат Фосамакс Остеопороз, болезнь Педжета, злокачественная гиперкальциемия
    Ибандронат Бондронат Гуморальная опухолевая гиперкальциемия

    Бисфосфонаты являются структурными аналогами пирофосфорной кислоты, естественного регулятора обмена кальция в организме. Влияние бисфосфонатов на обмен кальция проявляется в значительном снижении экскреции кальция почками, уменьшении почечной экскреции гидроксипролина, повышении уровня паротропного гормона или его стабилизации благодаря эффективному снижению уровня кальция. Бисфосфонаты связываются с кальцием и тем самым уменьшают возможность соединения кальция со щавелевой кислотой. 50% абсорбированного бисфосфоната экскретируется с мочой. В почках происходит его секреция. [37].

    19-27


    Назад Вперед


    реабилитационный центр в красногорске . привлекательные цены