Лекция 5

Перекисное окисление липидов

Повреждение компонентов биологических мембран при патологических процессах

Биологические мембраны наряду с элементами цитоскелета формируют ультраструктуру протоплазмы. Кроме того, они выполняют множество функций, нарушение любой из которых может привести к изменению жизнедеятельности клетки в целом и даже к ее гибели. На рис.1 дано схематическое изображение типичной мембраны с указанием тех ее элементов, повреждение которых может иметь место в патологии и лежать в основе развития различных заболеваний. Наиболее тяжелые последствия вызывает повреждение липидного слоя (или бислоя) мембран. Липидный слой клеточной и внутриклеточных мембран выполняет две основные функции - барьерную и матричную (структурную). Повреждение барьера приводит к нарушению регуляции внутриклеточных процессов и тяжелым расстройствам клеточных функций. С другой стороны, липидный слой мембран формирует в клетке особую жидкую фазу. На поверхности раздела водной и липидной фаз, а также внутри липидной фазы "плавают" многочисленные ферменты, многие субстраты биохимических реакций, белковые клеточные рецепторы, гликолипиды и гликолипопротеиды, образующие гликокаликс. Во многих клетках до 80% белков встроены в мембраны или связаны с их поверхностью. Липидный бислой выполняет, таким образом, роль структурной основы или матрицы для всех этих белковых, липопротеидных, гликопротеидных и гликолипидных компонентов мембран. От свойств липидной фазы мембран, таких, как вязкость, поверхностный заряд, полярность, зависит работа мембранных ферментов и рецепторов. Наличие гликокаликса характерно для наружных клеточных мембран. Он выполняет ряд функций, в частности, от него зависят свойства клеточной поверхности, способность клеток к фагоцитозу и адгезии с другими клетками. Гликокаликс эритроцитов препятствует их агглютинации. Повреждение гликокаликса приводит к тяжелым последствиям, помимо прочего еще и потому, что это приводит к изменению иммунных свойств клеточной поверхности. Действие многих токсических соединений направлено на белковые компоненты клеточной мембраны. Например, цианистый калий блокирует цитохромоксидазу - фермент, входящий в состав внутренних мембран митохондрий. Ионы тяжелых металлов (ртуть, серебро, свинец) связывают SH-группы белков, в том числе мембранных ферментов и ионных каналов, вызывая их инактивацию. На белки плазматических мембран или элементы цитоскелета направлено действие многих бактериальных токсинов. Изменения в активности мембранных ферментов, каналов и рецепторных белков, вызванные неблагоприятными факторами, также приводят к нарушению функции клеток и развитию заболеваний.

Основные механизмы нарушения барьерных свойств липидного слоя

Изучение воздействия разного рода повреждающих агентов на изолированные клетки (например, эритроциты), митохондрии, фосфолипидные везикулы (липосомы), плоские бислойные липидные мембраны (БЛМ) и другие модельные объекты показало, что, в конечном счете, существует всего четыре основных процесса, которые непосредственно обусловливают нарушение целостного липидного бислоя в патологии [Владимиров Ю. А., 1973]:

перекисное окисление липидов;
действие мембранных фосфолипаз;
механическое (осмотическое) растяжение мембраны;
адсорбция на бислое полиэлектролитов, включая некоторые белки и пептиды.

Чтобы понять роль этих процессов в развитии патологического состояния, надо знать химические и физические условия протекания каждого из них, пути их регуляции в живой клетке и причины ее нарушения, характер повреждения свойств мембран под действием данного процесса, биологические последствия такого повреждения мембран для жизнедеятельности клетки и организма в целом. Рассмотрим эти вопросы на примере наиболее изученного процесса – перекисного окисления (пероксидации) липидов.

Свободнорадикальное (перекисное) окисление липидов

Реакции, в которых образуются свободные радикалы

См. также соответствующий раздел в лекции №7.

Перекисное окисление (пероксидация) липидов - пример процесса, идущего с участием свободных радикалов. Свободные радикалы - это молекулярные частицы, имеющие непарный электрон на внешней орбитали и обладающие высокой реакционной способностью. Их изучение ведется методом ЭПР (спиновые ловушки), хемилюминесценции и путем применения ингибиторов реакций, в которых участвуют радикалы определенного типа. В таблице 1 дан перечень основных типов свободных радикалов, образующихся в организме человека.

Таблица 1. Свободные радикалы, образующиеся в клетках нашего организма

Радикал	Основной источник	Вредные реакции
Первичные радикалы:
Семихиноны	Цепи переноса электронов	HQ· + O₂ -> Q+ ·O^2- + H⁺
Супероксид	Клетки-фагоциты	·O^2- + Fe³⁺ -> O₂ + Fe²⁺
Монооксид азота(NO)	Клетки эндотелия и многие другие	NO· + ·O^2- -> OONO^- (пероксинитрит)
Вторичные радикалы:
Радикал гидроксила	H₂O₂ + Fe²⁺ -> Fe³⁺ + HO^- + HO· (реакция Фентона) HOCl + Fe²⁺ -> Fe³⁺ + Cl^- + HO· (реакция Осипова)	Повреждение ДНК и РНК, цепное окисление липидов
Радикалы липидов	Цепное окисление липидов	Повреждение липидного бислоя и мембранных ферментов
Радикалы антиоксидантов	Цепное окисление липидов	Иногда оказывают прооксидантное действие
Радикалы, обрзующиеся при метаболизме ксенобиотиков	Промышленные токсины инекоторые лекарства	Образование вторичных радикалов
Радикалы, образующиеся при действии света	Поглощающие свет вещества	Образование вторичных радикалов

Первичные радикалы

Основные радикалы, образующиеся в клетках - это радикалы кислорода (супероксид и гидроксильный радикал), монооксид азота, радикалы ненасыщенных жирных кислот, радикалы, образующиеся в окислительно-восстановительных реакциях (например, убихинол). Радикалы образуются также при действии ультрафиолетовых лучей и в ходе метаболизма некоторых чужеродных соединений (ксенобиотиков), в том числе некоторых препаратов, одно время применявшихся в качестве лекарств.

Активные формы кислорода

Основная масса молекулярного кислорода, потребляемого клетками нашего организма, непосредственно восстанавливается до воды, окисляя органические субстраты в цепях переноса электронов. Меньшая часть кислорода расходуется на неполное окисление органических соединений. Наконец, заметная часть кислорода восстанавливается клетками нашего организма до супероксидного радикала. Так клетки – фагоциты (моноциты и гранулоциты крови и тканевые макрофаги) выделяют супероксид в реакции, катализируемой ферментным комплексом – НАДФН-оксидазой:

НАДФН + 2O₂ -> НАДФ⁺ + 2O^•- (супероксид)

Дальнейшая судьба супероксидных радикалов может быть разной (см. схему на рис.2). В норме и при отсутствие ионов металлов переменной валентности супероксидные радикалы превращаются в перекись водорода; эта реакция катализируется ферментом супероксиддисмутазой (СОД) (реакция 2 на рис.2):

2O^•- -> H₂O₂ + O₂

Клетки-фагоциты используют перекись водорода, превращая ее в гипохлорит – соединение, разрушающее стенки бактериальных клеток; эта реакция катализируется ферментом миелопероксидазой (реакция 3 на рис.2):

H₂O₂ + Cl^- -> H₂O + ClO^-

Избыток перекиси водорода удаляется под действием двух ферментов: глутатионпероксидазы или каталазы (реакция 4 на рис.2):

В условиях патологии могут произойти нарушения либо системы защитных ферментов (в частности, снижение активности СОД), либо ферментных систем, связывающих ионы железа в плазме крови (церулоплазмин и трансферрин) и в клетках (ферритин). В этом случае супероксидные радикалы и перекись водорода вступают в альтернативные реакции: Образование двухвалентного железа из трехвалентного (реакция 7 на рис.2):

Fe³⁺ + O^•- -> Fe²⁺+ O₂

Реакция перекиси водорода и гипохлорита с ионами двухвалентного железа (реакции 9 и 10 на рис.2):

Fe²⁺ + H₂O₂ -> Fe³⁺ + HO^- + HO· (радикал гидроксила)

Fe²⁺ + ClO^- + H⁺ -> Fe³⁺ + Cl^- + HO· (радикал гидроксила)

Совокупность продуктов, образуемых активированными клетками-фагоцитами (радикалы супероксида и гидроксила, перекись водорода и гипохлорит) называют активными формами кислорода; некоторые авторы называют гипохлорит и продукты его метаболизма в тканях (такие как хлорамины R-NHCl) называют активными формами хлора. Радикалы гидроксила химически исключительно активны и вызывают повреждение белков, нуклеиновых кислот и липидов биологических мембран. Особенно тяжелые последствия имеют две последние реакции. Радикалы ·OH вызывают разрыв нитей ДНК, обладая, в зависимости от ситуации, мутагенным, канцерогенным или цитостатическим действием. С другой стороны, реагируя с ненасыщенными жирными кислотами, входящими в состав мембранных липидов, радикалы гидроксила инициируют цепную реакцию их пероксидации (перекисного окисления).

Цепное окисление липидов

См. также соответствующий раздел в лекции №7.

См. также лекцию «Кинетика реакций цепного окисления липидов».

Реакция цепного окисления липидов играет исключительную роль в клеточной патологии, и следует остановиться на ее механизме. Она протекает в несколько стадий, которые получили название инициирование, продолжение, разветвление и обрыв цепи (см. рис.3 и 4). Рассмотрим эти стадии подробнее.

Инициирование цепи

Радикал гидроксила, будучи небольшой по размеру незаряженной частицей, способен проникать в толщу гидрофобного липидного слоя и вступать в химическое взаимодействие с полиненасыщенными жирными кислотами (которые принято обозначать как LH), входящими в состав биологических мембран и липопротеинов плазмы крови. При этом в липидном слое мембран образуются липидные радикалы:

HO· + LH -> H₂O + L·

Липидный радикал (L·) вступает в реакцию с растворенным в среде молекулярным кислородом; при этом образуется новый свободный радикал - радикал липоперекиси (LOO·):

L· + O₂ -> LOO·

Продолжение цепи

Радикал LOO· атакует одну из соседних молекул фосфолипида с образованием гидроперекиси липида LOOH и нового радикала L·:

LOO· + LH -> LOOH + L·

Чередование двух последних реакций как раз и представляет собой цепную реакцию перекисного окисления липидов (см. рис.3).

Разветвление цепи

Существенное ускорение пероксидации липидов наблюдается в присутствии небольших количеств ионов двухвалентного железа. В этом случае происходит разветвление цепей в результате взаимодействия Fe²⁺ c гидроперекисями липидов:

Fe²⁺ + LOOH -> Fe³⁺ + HO^- + LO·

Образующиеся радикалы LO· инициируют новые цепи окисления липидов (рис.4):

LO· + LH -> LOH + L·;

L· + O₂ -> LOO· -> и т. д.

Обрыв цепей

В биологических мембранах цепи могут состоять из десятка и более звеньев. Но в конце концов цепь обрывается в результате взаимодействия свободных радикалов с антиоксидантами (InH), ионами металлов переменной валентности (например, теми же Fe²⁺) или друг с другом:

LOO· + Fe²⁺ + H⁺ -> LOOH + Fe³⁺

LOO· + InH -> In· + LOOH

LOO· + LOO· -> молекулярные продукты + фотон

Хемилюминесценция как метод изучения реакций, идущих с участием свободных радикалов

См. также лекцию №9.

Последняя реакция интересна еще и тем, что она сопровождается свечением (хемилюминесценцией). Интенсивность этой хемилюминесценции (ХЛ) очень мала, поэтому ее иногда называют "сверхслабым свечением". Интенсивность свечения пропорциональна квадрату концентрации свободных радикалов в мембранах, а скорость перекисного окисления прямо пропорциональна концентрации тех же радикалов. Поэтому интенсивность "сверхслабого" свечения однозначно отражает скорость липидной пероксидации в изучаемом биологическом материале, и измерение хемилюминесценции довольно часто используется при изучении перекисного окисления липидов в различных объектах. Измерение хемилюминесценции широко применяется также для изучения образования активных форм кислорода клетками крови и перитонеальными макрофагами. В присутствии специальных соединений – люминола и люцигенина – наблюдается хемилюминесценция изолированных лейкоцитов крови, макрофагов или просто разведенной цельной крови, если клетки-фагоциты продуцируют гипохлорит и радикалы кислорода (супероксид + гидроксил-радикал). Интенсивность хемилюминесцентных ответов клеток увеличивается в несколько раз при появлении очагов некроза в организме, например, после инфаркта миокарда, и напротив, угнетается при тканевой гипоксии; поэтому измерение клеточной хемилюминесценции может быть использовано в ряде случаев с целью выявления заболевания, оценки тяжести состояния больного и эффективности назначенного лечения.

Биологические последствия пероксидации липидов

См. также соответствующий раздел в лекции №7.

Увеличенное образование свободных радикалов в организме и связанное с этим усиление процессов пероксидации липидов (которое иногда называют "оксидативным стрессом") сопровождается рядом нарушений в свойствах биологических мембран и функционировании клеток. В таблице 2 приведены наиболее важные изменения в мембранных структурах при перекисном окислении липидов.

Таблица 2. Наиболее важные изменения в мембранных структурах при перекисном окислении липидов

Действие перекисного окисления на мембранные белки

Действие перекисного окисления на липидный слой мембран

Окисление тиоловых соединений

Повреждение переносчиков

Появление проницаемости для ионов

Повреждение транспортных АТФаз

Увеличение микровязкости мембран

Изменение поверхностного заряда мембран и липопротеинов

Уменьшение гидрофобного объема

Увеличение полярности липидной фазы

Увеличение проницаемости для ионов водорода

Увеличение проницаемости для ионов кальция

Окисление тиоловых групп мембранных белков

Этот процесс может приводить в результате к неферментативной реакции SH-групп со свободными радикалами липидов; при этом образуются сульфгидрильные радикалы, которые затем взаимодействуют с образованием дисульфидов либо окисляются кислородом с образованием производных сульфоновой кислоты:

Pr-SH + L· -> LH + Pr-S·

Pr₁-S· + Pr₂-S· -> Pr₁-SS- Pr₂

Pr-S· + O₂ -> Pr-SO₂· -> производные сульфоновой кислоты

Связанное с перекисным окислением липидов окисление белков и образование белковых агрегатов в хрусталике глаза заканчивается его помутнением; этот процесс играет важную роль в развитии старческой и других видов катаракты у человека. Большую роль в патологии клетки играет также инактивация ион-транспортных ферментов, в активный центр которых входят тиоловые группы, в первую очередь Ca²⁺-АТФазы. Инактивация этого фермента приводит к замедлению "откачивания" ионов кальция из клетки и, наоборот, к входу кальция в клетку, увеличению внутриклеточной концентрации ионов кальция и повреждению клетки. Наконец, окисление тиоловых групп мембранных белков приводит к появлению дефектов в липидном слое мембран клеток и митохондрий. Под действием разности электрических потенциалов на мембранах через такие поры в клетки входят ионы натрия, а в митохондрий - ионы калия. В результате происходит увеличение осмотического давления внутри клеток и митохондрий и их набухание. Это приводит к еще большему повреждению мембран.

Изменение свойств липидного слоя

Увеличение микровязкости мембран

Изменение поверхностного заряда мембран и липопротеинов

Уменьшение гидрофобного объема

Увеличение полярности липидной фазы

Увеличение проницаемости для ионов водорода

Увеличение проницаемости для ионов кальция

Увеличение проницаемости для ионов кальция – второй результат перекисного окисления липидов – связано с тем, что продукты пероксидации обладают способностью непосредственно увеличивать ионную проницаемость липидного бислоя. Так показано, что продукты перекисного окисления липидов делают липидную фазу мембран проницаемой для ионов водорода и кальция. Это приводит к тому, что в митохондриях окисление и фосфорилирование разобщаются, а клетка оказывается в условиях энергетического голода (т.е. недостатка АТФ). Одновременно в цитоплазму выходят ионы кальция, которые повреждают клеточные структуры. Третий (и быть может, самый важный) результат пероксидации – это уменьшение стабильности липидного слоя, что может привести к электрическому пробою мембраны собственным мембранным потенциалом, т.е. под действием разности электрических потенциалов, существующей на мембранах живой клетки. Электрический пробой приводит к полной потере мембраной ее барьерных функций.

Клеточные системы антирадикальной защиты

В нормальных условиях процесс перекисного окисления липидов находится под строгим контролем ферментативных и неферментативных систем клетки, от чего скорость его невелика. Принято делить химические соединения и физические воздействия, влияющие на скорость перекисного окисления липидов, на прооксиданты (усиливают процессы перекисного окисления) и антиоксиданты (тормозят перекисное окисление липидов). К прооксидантам в живой клетке относятся высокие концентрации кислорода (например, при длительной гипербарической оксигенации больного), ферментные системы, генерирующие супероксидные радикалы (например, ксантиноксидаза, ферменты плазматической мембраны фагоцитов и др.), ионы двухвалентного железа. Хотя сам процесс перекисного окисления развивается в виде цепных реакций в липидной фазе мембран и липопротеинов, начальные (а возможно, и промежуточные) стадии этой сложной системы реакций протекают в водной фазе. Часть защитных систем клетки также локализуется в липидной фазе, а часть - в водной фазе. В зависимости от этого можно говорить о водорастворимых и гидрофобных антиоксидантах. В таблице 3 приведены наиболее известные антиоксиданты.

Таблица 3. Наиболее известные антиоксиданты

Антиоксидант	Действие
Церулоплазмин (плазма крови)	Окисляет Fe²⁺ до Fe³⁺ молекулярным кислородом
Апо-белок трансферрина (плазма крови)	Связывает Fe³⁺
Ферритин (цитоплазма)	Окисляет Fe²⁺ и депонирует Fe³⁺
Карнозин	Связывает Fe²⁺
Супероксиддисмутазы (повсеместно)	Удаляет супероксид с образованием пероксида водорода
Каталаза (внутри клеток)	Разлагает пероксид водорода с выделением кислорода
Глутатион-пероксидазы (в цитоплазме)	Удаляет пероксид водорода за счет окисления глутатиона Удаляет гидроперекиси липидов
Глутатионредуктаза	Восстанавливает окисленный глутатион
Токоферол, тироксин, стероиды	Перехватывают радикалы липидов
Аскорбиновая кислота	Регенерирует окисляющиеся токоферол и убихинон
Глутатион	Используется для восстановления пероксидов

Антиоксиданты водной фазы

Основные реакции в водной фазе, предшествующие цепному окислению, и роль антиоксидантов в ограничении скорости этих процессов можно представить в виде схемы, приведенной на рис.5. Непосредственными предшественниками гидроксильного радикала, инициирующего цепное окисление липидов, служат ионы двухвалентного железа и перекись водорода (или образующийся из нее гипохлорит). По этой причине образование радикала гидроксила и пероксидация липидов тормозится веществами, снижающими концентрацию одного из этих двух соединений. К ним относятся:

Фермент супероксиддисмутаза, который снижает концентрацию супероксидных радикалов и тем самым препятствует восстановлению ими ионов трехвалентного железа до двухвалентного. В клетке ионы железа хранятся в трехвалентном состоянии в специальных депо, образованных субъединицами белка ферритина.
Ферменты каталаза и глутатион-пероксидаза, которые удаляют перекись водорода. Эффективность работы глутатион-пероксидазы зависит от концентрации свободного глутатиона, при снижении которой может возрастать концентрация цитотоксических гидроксильных радикалов.

Регенерация восстановленного глутатиона (GSH) из окисленного (GSSG) осуществляется за счёт НАДФН; этот процесс катализируется ферментом глутатионредуктазой. Недостаток глутатиона в клетках, например эритроцитах, который может быть обусловлен действием токсических веществ, например ионами тяжелых металлов или наследственным недостатком глутатионредуктазы приводит к активации перекисного окисления; это, в частности, наблюдается при некоторых видах гемолитических анемий.
Соединения, связывающие ионы железа (комплексоны). Надо, правда, оговориться, что в водной фазе некоторые комплексы ионов железа вступают в реакции с супероксидным радикалом и перекисью водорода наряду со свободными ионами железа в растворе.

Антиоксиданты, тормозящие развитие цепных реакций в липидной фазе

Основные реакции в липидной фазе биологических мембран и липопротеинов крови, а также место действия антиоксидантов в ограничении скорости этих процессов можно продемонстрировать с помощью схемы, приведенной на рис.6: Цепные реакции "ведут" свободные радикалы липидов (L· и LOO·), разветвление цепей происходит при взаимодействии продукта пероксидации – гидроперекиси липидов (LOOH) с ионами Fe²⁺. Все соединения, снижающие концентрацию перечисленных веществ, выполняют функцию антиоксидантов. Сюда относятся:

Ферменты фосфолипаза и глутатионпероксидаза, которые разрушают гидроперекиси липидов, предотвращая разветвление цепей окисления липидов в мембранах. При этом действие фосфолипазы заключается в отщеплении от фосфолипидов окисленной жирной кислоты, содержащей гидроперекисную группу (LOOH), а действие глутатионпероксидазы сводится к восстановлению этой группы до спиртовой с одновременным окислением глутатиона (GSH) до дисульфида (GSSG):

LOOH + 2GSH -> LOH + GSSG + H₂O
Ловушки радикалов, которые называют иногда "липидными антиоксидантами". По своей химической природе липидные антиоксиданты - это производные фенола. К ним относится a-токоферол (витамин Е), убихинон (коэнзим Q), тироксин и синтетические соединения, например ионол (бутилированный гидрокситолуол) (см. рис.7).
Соединения, связывающие железо. Большинство из них, включая такие природные соединения как дипептид карнозин, не просто связывают железо, но, самое главное, не дают ему возможности приникнуть в липидную фазу мембран, поскольку образующиеся комплексы, в силу своей полярности, не проникают в гидрофобную зону.

Для детоксикации двухвалентного железа в организме существует, по-видимому, целая система окисления и связывания ионов железа. В плазме крови эта система представлена ферментом церрулоплазмином (феррооксидазой), который окисляет Fe²⁺ до Fe³⁺ кислородом без образования свободных радикалов, и белком трансферрином, который связывает и переносит в кровяном русле ионы трехвалентного железа, которые затем захватывается клетками. В клетках железо может восстанавливаться аскорбиновой кислотой и другими восстановителями, но затем окисляется и депонируется в окисленной форме внутри ферментного белкового комплекса ферритина.

Вопросы для самоконтроля

Мембранные структуры, повреждаемые при действии неблагоприятных факторов. Основные механизмы нарушения барьерных свойств мембран в патологии.
Свободные радикалы. Определение и классификация.
Происхождение и метаболизм супероксид-радикала.
Происхождение и действие на клеточные структуры радикала гидроксила.
Основные реакции цепного окисления липидов.
Действие процесса перекисного окисления липидов на клеточные структуры (белки и липиды) – перечислить.

ПОКАЗАТЬ ПЛАН ПЕРЕЙТИ В НАЧАЛО