[143]
До сих пор мы обсуждали информационные аспекты клеточного повреждения, связанные с нарушениями сигнализации, восприятия и передачи управляющих сигналов, л также с дефектами адаптационных программ клетки. Однако проблема клеточного повреждения имеет и другую, очень важную сторону. Повреждение приводит к типовым изменениям в различных отсеках клетки. Данный раздел посвящен современным данным о патохимических закономерностях повреждения клеточного «исполнительного аппарата». Вначале мы рассмотрим их по отдельности, применительно к различным органеллам, а затем опишем интегральные механизмы различных способов гибели клетки.
Повреждение ядерной ДНК вызывает несколько типовых защитных реакций. Однако, каждый из этих механизмов «погрешим» и, срабатывая, становится причиной вторичных нарушений (рис.27).
Рассмотрим это на конкретных примерах. Выше уже шла речь о системе эксцизионной репарации пиримидиновых димеров и однонитевых разрывов ДНК и о потенциальных опасностях, связанных с ее несовершенной работой.
К этому можно добавить, что эндонуклеазы, играющие важную роль в работе репаразной системы, при определенных условиях могут обеспечить начало апоптоза — запрограммированной гибели поврежденной клетки с фрагментацией ее ДНК. Более того, подобный «вызов огня на себя» для устранения повреждения вместе с клеткой, которая его несет, по-видимому, является достаточно характерным результатом повреждения ядра, так как очень многие повреждающие агенты индуцируют апоптоз клеток-мишеней, а конституциональный элемент системы препарирования мутаций — ген р53, упоминавшийся выше, как «замораживатель» митотического цикла поврежденных клеток в G1-фазе, известен также как ген-индуктор апоптоза.
Достаточно типичным биохимическим последствием повреждения хроматина служит усиление метилирования и АДФ-рибозилирования ДНК и ядерных белков.
Известно, что в хроматине активные гены менее метилированы, поэтому первая из данных биохимических реакций может отражать инактивацию во время клеточного повреждения ряда «неэкстренных» текущих клеточных программ, которые на период острой адаптации к повреждению архивируются.
Что же касается роли и последствий усиления поли-АДФ-рибозилирования, то эта сторона ядерного ответа на повреждение может весьма драматически влиять на судьбу поврежденной клетки. В присутствии поврежденной ДНК активируется фермент поли-АДФ-рибозилполимераза (ПАРП). Фермент превращает остатки НАД в поли-АДФ-рибозу и вызывает сшивку белков хроматина через поли-АДФ-рибозильные мостики. Данный [144] механизм является универсальным для всех живых клеток. Он направлен прежде всего на закрепление концов разорванной хроматиновой нити и, фактически, участвует в работе репаразной системы, склеивая разрывы, препятствуя транскрипции поврежденной ДНК и, возможно, ограничивая хромосомные аберрации. Однако, активная работа ПАРП приводит к лавинообразному накоплению поли-АДФ-рибозилов и истощению пула никотинамид-динуклеотида, вследствие чего ресинтез макроэргических соединений в клетке тормозится. При нехватке энергии пуриновые основания превращаются в гипоксантин и мочевую кислоту, а этот процесс сопровождается выделением супероксидных анионов. Образование активных кислородных радикалов при формировании мочевой кислоты — давно известный медицинский факт. Именно эта особенность конечных этапов синтеза мочевой кислоты приводит к обострению воспалительных явлений у подагриков всякий раз, когда они нарушают диету и испытывают пуриновую нагрузку. Но наиболее поразительно, что этот же процесс участвует в опосредовании клеточной гибели после ядерных повреждений. Активные радикалы кислорода наводняют ядро и вызывают вторичное самоповреждение ДНК, усугубляя нарушения в работе генома.
Активация поли-АДФ-рибозилирования считается важным механизмом апоптоза, а, возможно, и некробиоза. По крайней мере, ее ингибиторы — большие дозы витамина РР, оксимы и т.д. — обладают цитопротекторным действием и тормозят апоптоз и некроз.
В поврежденных клеточных ядрах происходит включение целого ряда аварийных генетических программ, считывание которых в нормальных условиях отсутствует или минимально.
К ним относятся:
•Гены белков теплового шока (БТШ);
•Немедленные гены предраннего ответа;
•Антионкогены;
•Гены-регуляторы программировали клеточной гибели;
•Ген маркера стареющих и поврежденных клеток (АСК).
Работа каждой из этих генетических систем сочетает защитные и вторичные повреждающие эффекты, иллюстрируя концепцию биологической погрешимости. [145]
Белки теплового шока (БТШ) — многофункциональные клеточные регуляторы, унаследованные нами, вероятно, от первых прокариотических клеток. По крайней мере, их структура консервативна, а их функции делают эти молекулы непременными участниками ответа на повреждение у различных клеток — от бактериальных до человеческих.
Впервые они были обнаружены в клетках дрозофил, подвергавшихся тепловому воздействию. Это, однако, не означает, что экспрессия данных белков специфична только для тепловой травмы, напротив, она может быть индуцирована различными воздействиями воспаление, инфекция, гипоксия, химические повреждения клеток тяжелыми металлами, мочевиной, перекисью водорода, мышьяком и этиловым спиртом).
Вместе с тем, повышенная экспрессия БТШ увеличивает и температурную устойчивость клеток, поэтому их название не случайно.
Считается, что БТШ могут представлять собой систему белковых клеточных детергентов и регуляторов ограниченного протеолиза. В этом качестве они способны поддерживать нативную конформацию синтезируемых в клетке белков, предохранять их от денатурации и солюбилизировать белки, которые при клеточном стрессе утрачивают свою растворимость, либо способствовать протеолизу денатурированных белков.
БТШ синтезируются в небольших количествах и в норме и могут, в частности, принимать участие в регуляции клеточной пролиферации, обеспечивая конденсацию хромосом при митозе. Пусковым сигналом для экспрессии повышенных количеств БТШ служит, по-видимому, протеолиз некоего сигнального фактора теплового шока. Продукты этого протеолиза или сам денатурированный белок действуют на промоторы генов БТШ и запускают их считывание.
Синтез БТШ и их функции требуют затраты макроэргических соединений и, по-видимому; могут предохранять клетку от гибели вплоть до развития тяжелой тканевой гипоксии.
Выделяют 4 группы БТШ, различных по молекулярному весу и функциям:
1.Белки с молекулярной массой 84-110кДа
2.Белки с молекулярной массой 70кДа
3.Белки с молекулярной массой 15-30кДа
4.Белки с молекулярной массой 8,5-12кДа
Наиболее высокомолекулярные БТШ взаимодействуют с рецепторам, стероидных гормонов, предупреждая в отсутствие стероидов ассоциацию рецепторов с хроматином. Это может рассматриваться, как блокада осуществления стрессорных адаптационных программ до наступления стресса, который характеризуется высоким уровнем воздействия стероидных гормонов на клетки. В условиях стресса действие этой группы БТШ может служить предохранительным механизмом против избыточной стимуляции, а для некоторых клеток, где стероиды индуцируют запрограммированную гибель, например, для лимфоцитов — прямым «буфером», увеличивающим выживаемость.
Таким образом, БШТ. — своеобразный механизм, сопрягающий стресс на уровне целостного организмам, стрессорный ответ отдельных клеток,.Так, БТШ hsp90 образует комплекс с рецепторами стероидов и увеличивает аффинность этих рецепторов. Более того, комплекс рецептора и данного БТШ способен связывать иммунофиллины — внутриклеточные мишени иммунодепрессантов типа циклоспорина. Возможно, это означает, что БТШ имеют прямое отношение к влиянию стресса на иммунитет (П.Бриан, 1992).
БТШ 70кДа считается центральным звеном во всей системе белков теплового шока. Его и близкие к нему по массе БТШ называют шаперонины — от английского «shape» — форма, так как они осуществляют поддержание нативной конформации белков и сопровождают белковые молекулы после трансляции в различные отсеки клетки и к месту образования макромолекулярных комплексов. Эта функция «молекулярных шин» или солюбилизаторов энергозависима и предохраняет белки цитоплазмы и ядра от агрегации и денатурации, которая является неотъемлемой частью необратимого повреждения клеток. [146]
Продукты ограниченного протеолиза самого БТШ-70 могут служить молекулярными сигналами для экспрессии других БТШ.
При повреждении клетки синтезируемый БТШ-70 мигрирует в ядро и связывается с хроматином и ядрышком, взаимодействуя с топоизомеразой и гистонами. Предполагается, что это необходимо для предохранения от мутаций и обеспечивает условия для работы репаразной системы (либо через влияние на протеолиз белков хроматина, либо через восстановление конденсированного состояния хроматина).
В цитоплазме белки, близкие к БТШ-70, индуцируются при повреждении клетки и взаимодействуют с микротрубочками и микрофиламентами, вероятно, стабилизируя цитоскелет и увеличивая устойчивость клеток к механическому повреждению, денатурации и агрегации цитоплазматических белков. Агрегация элементов цитоскелета, в частности, прекератиновых промежуточных филаментов, является характерным неспецифическим компонентом повреждения клеток, а указанные агрегаты входят в состав вещества, образуемого в поврежденной клетке и известного в патологической анатомии как «алкогольный гиалин», так как оно впервые было описано Меллори в виде особых телец в поврежденных гепатоцитах алкоголиков. По-видимому, с возрастом способность некоторых клеток, в частности, адренокортикоцитов, генерировать БТШ- 70, снижается, и это считают одним из возможных механизмов клеточного старения (М.Дж.Блейк и др., 1991).
БТШ из группы 15-30 кДа также способны взаимодействовать после повреждения клетки с элементами хроматина и оказывать действие на осуществление клеточного цикла, а также повышать устойчивость клеток к некрозу, по крайней мере, в миокарде. Этот эффект лежит в основе феномена, названного Ф.З.Меерсоном «адаптационной стабилизацией структур», что проявляется в увеличении резистентности клеток к гипоксии и аутолизу после кратковременного стресса. Очевидно, что БТШ могут, по крайней мере, частично обуславливать неспецифическое повышение устойчивости организма к острой гибели, наблюдаемое при стрессе.
Низкомолекулярная группа БТШ представлена убиквитинами (от «ubiquitous» — вездесущий). Убиквитины могут рассматриваться, как рецепторы для специфических протеаз. Ядерные и цитоплазматические белки, к которым прикрепляются убиквитины, подлежат внелизосомальному протеолизу.
Ограниченный протеолиз, как способ каскадной активации тех или иных ферментативно-рецепторных систем, широко применяется в живых клетках. На ограниченном протеолизе, при котором продукт протеолитической реакции является ферментом, ускоряющим следующий шаг протеолиза, построена работа системы комплемента, свертывающей и противосвертывающей систем крови, кининовой системы. Возможно, убиквитинизация необходима для устранения денатурированных белков или запуска протеолитических сигнальных систем в поврежденной клетке.
При повреждении клеток убиквитины могут запустить протеолиз и в клеточных ядрах, вызывая лизис гистонов, антионкобелка р53 и циклина внутри клеточных ядер.
Считается, что протеолиз гистонов может приводить к запуску ферментов-эндонуклеаз и фрагментации хроматина, протеолиз циклина может останавливать размножение дефектных клеток, а протеолиз белка р53 может приводить к его активации и срабатыванию программы клеточной смерти. Убиквитинизация белков хроматина и повышение синтеза убиквитинов обнаруживается при апоптозе клеток настолько регулярно, что некоторые патологи считают эти белки маркерами апоптоза. Таким образом, БТШ — элементы наиболее древних, неспецифических механизмов клеточной реактивности, БТШ способны оказывать цитопротекторное действие при повреждении, предохраняя клетку и от апоптоза и, в определенной степени, на ранних стадиях, до развития тяжелой гипоксии — также и от некроза.
Первичная структура БТШ на 50-60% идентична у бактерий и человека, иммунный ответ [147] на БТШ микробов и паразитов, особенно, на иммунодоминантные БТШ-70, 65, 90, 10, запускает у человека перекрестный аутоаллергический процесс. Умеренный аутоиммунитет к БТШ-65 физиологичен, но его усиление может привести к развитию артрита и диабета И.Кохен, 1991; В.ВанИден, 1990; Т.Шинник, 1991).
Весьма фундаментальным значением обладает, на наш взгляд, тот факт, что работа системы БТШ способна как предохранять клетки от преждевременной запрограммированной гибели (БТШ-70), так и индуцировать ее убиквитины). Повреждение способно индуцировать программы, устраняющие сами поврежденные клетки.
При повреждении клеток различных органов и тканей, вне зависимости от причин этого повреждения, происходит очень быстрая неспецифическая активация ряда генов (c-fos, c-un, c-myc и nur77), которые были условно объединены под названием «немедленные гены предранней реакции» (НГПР).
Считается, что НГПР способны активировать клеточную пролиферацию, в том случае, если их считывание в клетках происходит на фоне достаточного количества ростовых сигналов. Эти ростовые сигналы обеспечиваются тканеспецифическими факторами роста и обуславливают высокую активность ядерного фермента орнитиндекарбоксилазы и достаточные для клеточной пролиферации количества полиаминов — спермина и спермидина. Таким образом, работа НГПР может рассматриваться, как подготовка к репаративным процессам при повреждении тканей.
Вместе с тем, продукты тех же самых НГПР могут запустить процесс запрограммированной клеточной гибели, если ростостимулирующий фон недостаточен.
Ген c-myc является важным регулятором клеточного размножения, а при его сверхактнвации наступает озлокачествление клетки, в связи с чем впервые он был описан, как протоонкоген, экспрессия которого обнаруживалась при злокачественной лимфоме Беркитта. Ген кодирует ядерный фосфопротеин, способствующий переходу клетки из G1 в S-фазу митотического цикла.
Предполагается, что ген может регулировать количество G1-циклинов или орнитиндекарбоксилазы в клетке, возможно, через ДНК-связывающую и ДНК-димеризующую активность своих продуктов.
Продукты гена c-myc образуют димеры с продуктами другого гена Мах, и этим гетеродимерам приписывается центральная роль в регуляции клеточного цикла.
Во многих клетках активация данных генов при недостаточном уровне ростовых сигналов запускает апоптоз. Однако, при апоптозе лимфоцитов под действием глюкокортикоидов, экспрессия c-myc, наоборот, снижается. По некоторым данным, запуск гена c-myc может увеличить вероятность генетических рекомбинаций и амплификации генов в клетке. Это создает потенциальный риск соматических мутаций и видоизменения пролиферирующего клона.
Ген Nur77 кодирует ядерный рецептор стероидных гормонов. Его активная экспрессия в различных клетках может быть достигнута при их повреждении или, как это ни парадоксально, при действии факторов роста. Имеются данные, что экспрессия генов стероидных рецепторов достигается при стрессе, как клеточный коррелят общего адаптационного синдрома. Не исключено, что индукция апоптоза при участии данного гена ответственна за некоторые гематологические проявления стресса, например лимфопению и эозинопению.
Гены c-fos и c-jun известны, как регуляторы клеточной пролиферации и гибели в эмбриогенезе. В зрелых дифференцированных клетках их активность подавлена и усиливается при повреждении. В тканях с очень коротким сроком жизни клеток (эпидермис) ген c-fos экспрессировав постоянно.
В нейронах c-fos, с одной стороны, считается геном смерти, срабатывающим при апоптозе [148] нейронов в результате ишемических или дегенеративно-дистрофических заболеваний ЦНС, а, с другой стороны — участвует во внутриклеточном опосредовании действия фактора роста нервов (Р.Леви-Монтальчини, 1986).
Такая биполярность эффектов, принадлежащих к сфере действия одной и той же регуляторной системы необъяснима, если придерживаться простой двоичной логики и разделять полом и защиту, как это делается в рамках доктрины монокаузализма. Непонятно, как совместить это с механическим постулатом, гласящим, что нажатие на одну и ту же кнопку должно давать один и тот же эффект. И здесь хочется напомнить читателю о фундаментальном принципе химической биорегуляции—принципе пермиссивности биологических эффектов регуляторов, открытом за 60 лет до описания НГПР блестящим отечественным патофизиологом Л.Р.Перельманом (ЛПМИ).
Он обнаружил, что последствия паратиреоидэктомии у животных принципиально отличаются в зависимости от того, на каком гормональном фоне она проводится. Обычно паратиреоидэктомия ведет из-за дефицита паратгормона к гипокальциемии и судорогам, что известно в патофизиологии, как «паратиреопривная тетания». Однако, предварительная экстирпация семенников предотвращает судороги, вызванные паратиреоидэктомией, даже, несмотря на низкий уровень кальция.
Следовательно, одни химические сигналы могут изменять характер и результаты ответа клеток на другие, даже не обращаясь при этом к тем же самым клеточным рецепторам — через иные звенья метаболизма.
Пермиссивный принцип делает связи между сигналом и ответной реакцией неоднозначными, а саму химическую регуляцию клеток — ансамблевой, непохожей на простое последовательное нажатие кнопок-рецепторов на клавиатуре некой механической машинки.
Через 47 лет после исследований Л.Р.Перельмана было обнаружено, что контроль экспрессии катехоламинового рецептора в клетках осуществляют глюкокортикоиды, тем самым был расшифрован один из молекулярных механизмов наиболее известного примера перельмановского «пермиссивного действия гормонов».
Пермиссивное действие различных регуляторов клеточного роста, на наш взгляд, определяет и двойственный характер результатов экспрессии НГПР.
Таким образом, работа одних и тех же клеточных программ на разном пермиссивном фоне может приводить к диаметрально противоположным последствиям — гибели клетки или ее делению.
Выше, при рассмотрении вопроса об антимутационных защитных механизмах клеток, мы уже упоминали об антионкогенах.
Как и многие другие названия в медицине, данное наименование связано с обстоятельствами открытия первого из этого семейства генов — гена Rb, наличие которого, даже в гетерозиготном состоянии, предохраняло носителей от развития злокачественной ретинобластомы. Соответственно роли гена Rb, вся группа генов стала именоваться «супрессорами опухолей» или антионкогенами. На деле роль генов данной группы шире, чем функция, отраженная в их названии. Продукты антионкогенов, например, широко известного «молекулярного полицейского» — гена р53, это регуляторы генной стабильности, останавливающие митотический цикл в мутировавших клетках в стадии G1 Остановка цикла дает мутантной клетке время для срабатывания репаразных механизмов. Если мутация не репарируется, продолжение экспрессии р53 и его аналогов ведет к запуску программы апоптоза клеток с поврежденной ДНК.
Исход «срабатывания» р53 зависит, как и для НГПР, от пермиссивного фона, создаваемого концентрацией других регуляторов роста и апоптоза.
Ген р53 — важный участник гибели клеток, обусловленной радиацией и химическими [149] мутагенами. Это означает, что клеточная гибель в подобных ситуациях не может рассматриваться как чистая модель «полома», поскольку содержит элементы запрограммированной и защитной, для организма в целом, гибели.
Рассматривая проблему наиболее общих, неспецифических изменений в экспрессии генов, вызываемых повреждением клетки, нельзя обойти стороной представления об антигене-маркере стареющих и поврежденных клеток.
В начале 80-х годов Маргарет Кей и соавторы обнаружили, что один из белков поверхностной мембраны красных кровяных телец, движущийся при электрофорезе в составе третьей полосы и выполняющий функции ионного канала, практически отсутствует или скрыт поверхностными гликопротеидами мембраны в молодых клетках и, наоборот, активно экспрессируется в мембране старых и поврежденных эритроцитов.
Впоследствии оказалось, что данная молекула является маркером, появляющимся на мембране после истечения онтогенетически отпущенного эритроцитам срока в 100 дней — то есть, в буквальном смысле, опознавательным знаком стареющих клеток (рис.28).
Позднее и в других клеточных пулах — у стареющих тромбоцитов, лейкоцитов, а затем и у клеток некостномозгового происхождения — например, в клетках легкого и кожи, был обнаружен тот же маркер. Таким образом, данному белку была отведена роль нетканеспецифического знака, связанного с терминацией жизненного цикла клеток.
Выяснилось, что различные клеточные повреждения эритроцитов (от мутаций — при микросфероцитозе, до гиповитаминоза — при мегалобластических анемиях) ускоряют экспрессию маркера старения и укорачивают жизнь эритроцитов.
Более того, устранение снабженных этим маркером клеток, как оказалось, происходит при участии аутофагоцитоза, а роль опсонинов, через которые фагоциты прикрепляются к обреченным на гибель клеткам, выполняют физиологические аутоантитела к маркеру старения.
Таким образом, маркер или антиген стареющих клеток оказался частью фундаментального механизма запрограммированного устранения из организма тех клеточных элементов, которые исчерпали вследствие изнашивания или повреждений свой генетический ресурс.
Представления о внутриклеточном гемолизе посредством фагоцитоза, как о механизме гибели клеток крови существовали и ранее, но не был ясен молекулярный механизм отбора клеток, подлежащих устранению.
Еще в 1884 году, всего через год после открытия И.И.Мечниковым фагоцитоза, ученик первооткрывателя А.О.Ковалевский наблюдал исчезновение провизорных органов у личинок мухи при участии фагоцитов и пророчески предположил, что фагоцитоз не только и не столько защитный механизм, сколько способ устранения собственных клеток, отработавших свою онтогенетическую программу.
Однако в дальнейшем внимание медиков сосредоточилось на защитной роли фагоцитоза и поколениям студентов и врачей казалась еретической сама мысль о том, что классический механизм защиты от чужого может быть также и способом повреждения своего.
Как это ни странно, Джордж Бернард Шоу, не имевший медицинского образования, устами одного из героев пьесы «Дилемма врача» в 1921 году высказал суждение, зазвучавшее после работ Маргарет Кей вполне современно: «Не происходит ли избыточная стимуляция фагоцитов? Не пожирают ли они, наряду с бациллами, и красные кровяные тельца, прикрепляясь к ним и разрушая их?»
После открытия антигена стареющих клеток можно говорить о конкретизации понятия «морфогенетическая роль фагоцитоза», введенного В.В.Максимовым. Оказывается, одним из неспецифических последствий [150] повреждения клетки или ее онтогенетического старения может быть индукция специального маркера, провоцирующего запрограммированную насильственную гибель клетки путем аутофагоцитоза, а сам этот механизм дополняет запрограммированное самоубийство клеток или апоптоз.
Предполагается, что в безъядерных постклеточных структурах типа эритроцитов должны существовать ультрадолгоживущие РНК маркера старения, экспрессируемые только после того, как в них произойдут с течением времени или вследствие клеточного повреждения какие-то структурные изменения. Таким изменением может быть, например, утрата полиаденилового «хвоста» молекулы РНК, которая происходит постепенно и может играть роль клеточных «часов».
Повреждение клетки может ход этих часов ускорить.
По мнению Кей, антиген стареющих клеток может быть связан как с анионным транспортом, так и косвенно — с другим компонентом эритроцитарных мембран — гликофорином С-белком, обеспечивающим транспорт глюкозы в красные кровяные клетки (рис.28). Известна роль белка третьей полосы в мембранном заякоривании элементов цитоскелета. Экспрессия белка третьей полосы может рассматриваться, как попытка улучшить захват глюкозы, который в стареющих клетках нарушается или откорректировать механизмы ионного транспорта. Однако, эта форма адаптации приводит к стимуляции механизма, устраняющего стареющие и поврежденные клетки.
Концепция маркера стареющих клеток может показать, как реализуется запрограммированное онтогенетическое устранение клеток в многоклеточном организме, отводя иммунной системе центральную роль «синхронизатора» биологических часов различных органов и тканей.
По сути дела, кроме запрограммированного самоубийства поврежденной или онтогенетически изношенной клетки, или апоптоза, в распоряжении многоклеточного организма имеется и способ запрограммированной насильственной гибели таких клеток — через экспрессию особого маркера, аутоиммунный ответ и аутофагоцитоз. Не исключено, что эти явления взаимосвязаны, поскольку известно, например, что тельца, появляющиеся в результате апоптоза, устраняются путем аутофагоцитоза. В любом случае, антиген стареющей клетки представляет собой некий спусковой крючок, инициирующий определенное разрушительное для клетки, но необходимое для организма запрограммированное событие. [151]
Весьма заманчива идея повлиять на экспрессию белка третьей полосы в опухолевых клетках, дабы укоротить срок их жизни, разрабатываемая в настоящее время основоположниками представлений об антигене стареющих слеток. Кей и соавторы предприняли с этой целью даже попытку получить антиидиотипические информационные копии антигена стареющих клеток или синтетические пептиды, аналогичные его доменам (М.Кей, Дж.Маршалонис, 1991).
Итак, последствия повреждения клеточных ядер неоднозначны, так как включаемые при этом генетические программы и саногенны и патогенны — в одно и то же время. Конкретный результат определяется влиянием множества факторов, по сути, пермиссивных по отношению к данному сигналу или воздействию.
Рассмотрим вначале последствия повреждения поверхностного аппарата клеток, включая плазматическую мембрану, подмембранную систему клетки и надмембранные структуры.
Повреждение плазматической мембраны клеток, независимо от его причины (механический или осмотический разрыв, электрический пробой, излучения, ультразвук, поле СВЧ) вызывает ряд типовых патохимических изменений, которым соответствуют характерные патохимические и морфологические картины. Ю.А.Владимиров выделяет 4 основных типа повреждения плазматических мембран:
•Перекисное окисление их компонентов;
•Гидролиз фосфолипазами;
•Механо-осмотическое растяжение;
•Адсорбция на мембране избытка полиэлектролитов (1994).
Практически любые причины, вызывающие формирование активных свободных радикалов-окислителей (радиация, озон и высокие концентрации кислорода, яды-окислители, воспаление) вызывают в мембране перекрестное связывание сульфгидрильных групп поверхностных белков, сшивку липидных молекул и перекисное окисление жирных кислот. Вследствие этого могут срезаться или менять свое местоположение в мембране концевые участки трансмембранных гликопротеидов, в том числе, клеточных рецепторов, а также освобождаются токсичные для клеток продукты распада, например, малоновый диальдегид. Перекисные изменения могут аутокаталитически, каскадно нарастая, распространяться вдоль мембраны и на внутриклеточные мембранные структуры. Некоторые агенты, способные связывать сульфгидрильные группы, в частности, ионы ртути, свинца, серебра и других тяжелых металлов, выводят из строя ионные каналы, повышая проницаемость мембран сразу и для катионов, и для анионов.
Проникновение избытка кальция в клетку, вызванное гипоксией или действием тяжелых металлов, активирует мембранные фосфолипазы (см. с.154), развертывающие дальнейший гидролиз липидного бислоя.
На начальной, обратимой стадии клеточного повреждения, это выражается структурно в образовании цитоплазматических выпячиваний на поверхности клетки. У клеток, обладающих микроворсинками, они могут сглаживаться и исчезать. В эпителиальных клетках неспецифическим, филогенетически древним ответом на раздражение и повреждение может, по некоторым данным, служить образование филоподий. Нарушаются межклеточные контакты.
В дальнейшем, прогрессирующее повреждение клеточных мембран приводит к формированию миелиновых фигур, в результате диссоциации белковых и липидных компонентов мембраны, обнажения гидрофобных фосфатидов и захвата воды, расслаивающей мембрану.
При необратимом повреждении в плазмолемме наблюдаются разрывы. Последствием [152] глубокого повреждения клеточных мембран является выход составных частей клетки в межклеточную жидкость. Этот феномен вызывает ряд важных последствий на тканевом уровне и учитывается диагностической медициной.
Многие вещества в норме присутствуют только внутриклеточно. Так например, клетки не обмениваются АТФ и производят это важнейшее макроэргическое фосфатное соединение по эгоистическому принципу — каждая только для себя (Дж.Л.Гордон, 1986). За кажущимся эгоизмом стоит важный принцип межклеточного сотрудничества: в многоклеточном организме оно не основывается на иждивенчестве или паразитизме. Если клетки сотрудничают, они обмениваются энергией не в виде заимствования АТФ, а в форме совместной полезной работы. Скажем, кардиомиоциты предсердий не синтезируют АТФ на экспорт — в желудочки сердца, однако сокращение предсердий перерастягивает желудочки и способствует синтезу желудочковыми кардиомиоцитами дополнительных макроэргических эквивалентов. ДНК каждой клетки принадлежит только ей и не используется в качестве программного аппарата соседними клетками.
Вследствие этого, появление внеклеточной АТФ и ДНК — безусловный признак беды для защитных систем организма, так как это принципиальный маркер разрушения клеток! Не случайно внеклеточные ДНК и АТФ являются мощными хемоаттрактантами и привлекают в очаги клеточного повреждения фагоцитирующие лейкоциты, призванные «расчистить развалины».
Синдром цитолиза, сопровождающий глубокое повреждение плазматических мембран клеток, регистрируется по появлению в межклеточной жидкости или в крови избытка ферментов, субстратов и ионов, в норме преобладающих или присутствующих исключительно во внутриклеточном секторе. Так, при гепатолизе появляются сорбитолдегидрогеназа, глютамико-пировиноградная и глютамико-щавелевая трансаминазы, в норме присутствующие внутри гепатоцитов. Внутрисосудистый гемолиз сопровождается гемоглобинемией и билирубинемией свободным билирубином. Любой массированный цитолиз приводит к гиперкалиемии.
Патофизиологические нарушения функций плазматической мембраны при ее повреждении связаны, прежде всего, с утратой трансмембранных градиентов, активно поддерживаемых живой клеткой. Градиенты могут утрачиваться вследствие усиления протечек вызванного действием сульфгидрильных ядов или механическими разрывами. Но наиболее типичной причиной служит нарастающий походу развития клеточной гипоксии дефицит энергии. Основным потребителем энергии в клетке является натрий-калиевая АТФ-аза, утилизующая в покое до 30% энергии основного обмена. При энергодефиците функция этот» фермента нарушается в первую очередь, что ведет к деполяризации мембраны. Сходные градиентсоздающие системы поддерживают в цитоплазме относительно невысокую концентрацию кальция, способного существенно повлиять на работу цитоскелета и митохондрий, а также на арахидоновый и протеолитический каскады.
При повреждении клетки мембранный калий-натриевый градиент всегда сглаживается наблюдается избыток внутриклеточного натрия, осмотическая активность которого удерживает в клетке избыток воды, в то же время вне клетки увеличивается концентрация калия. Фокальное повреждение ткани и массивный некроз клеток в организме из-за этого сопровождаются местным избытком калия в очаге воспаления и/или системной гиперкалиемией. В то же время, умеренная степень гипоксического повреждения клеток всегда сопровождается их "мутным набуханием", а при более глубокой гипоксии возможен и больший избыток внутриклеточной жидкости» проявляющийся «баллонной дистрофией». Набухание клетки может повлечь опасные для ее соседей последствия. Ю.А.Владимиров указывает, что этот процесс может нарушать микроциркуляцию в ткани, переносящей кислородное [153] голодание, замыкая порочный круг, усиливающий гипоксию (см. также выше, раздел «Этиология и патогенез»). Это особенно значимо в трансплантологии, имеющей дело с нарушениями кровоснабжения трансплантата вследствие гипоксического набухания его клеток при хранении. Не только натриевый, но и кальциевый градиент сглаживается при повреждении плазмолеммы.
Как уже отмечалось выше, избыток внутриклеточного кальция активирует мембран-фосфолипазыА, приводя к освобождению из фосфолипидов самой поврежденной мембраны арахидоновой кислоты, которая затем каскадно превращается в так называемые эйкозаноиды, являющиеся медиаторами воспаления. При участии этих медиаторов альтерация клетки перерастает в координированный ответ, вовлекающий соседние тканевые структуры. Сама же поврежденная мембрана выпускает наружу избыток внутриклеточного калия, становится нестабильной и электрически пробивается собственным потенциалом. Силы поверхностного натяжения препятствуют электрическому пробою мембраны и стягивают дефекты липидного бислоя. Однако, в условиях повреждения клетки как целого действуют такие факторы, как активные кислородные радикалы и эндогенные детергенты, например мыла (см. ниже), способные разрыхлять бислой и облегчать его пробой.
Интересно, что мембранный холестерин является мощным стабилизатором липидного бислоя. Эта молекула, безосновательно превращенная пропагандистами здоровых диет в символ зла и патологии, в действительности является необходимым для клетки компонентом и сильно увеличивает резистентность плазматических мембран к электропробою и дезинтеграции (Ю.А.Владимиров, 1994). Но, увеличивая устойчивость клетки к одним повреждениям, высокий уровень мембранного холестерина способен заставить некоторые клетки вступать в атерогенез и/или претерпевать повреждения другого рода. Вязкая мембрана богатых холестерином гладкомышечных клеток затрудняет работу кальциевого насоса и ведет к стимуляции деления и пенистой трансформации этих клеток из-за нарастания концентрации свободного цитоплазматического кальция, что способствует формированию атером.
Жесткая мембрана насыщенных холестерином эритроцитов более прочна при механическом повреждении, но это делает красные кровяные клетки менее конфигурабильными при транспорте через капилляры и способствует ишемическим нарушениям микроциркуляции (Ю.М.Лопухин, 1986). В.М.Дильман (1981) считал низкий уровень холестерина одновременно фактором антириска для атеросклероза и фактором риска для канцерогенеза. Амбивалентность мембранного холестерина, как защитного для клеток и патогенного на тканевом уровне фактора — очень характерный пример «погрешимости» защитных механизмов.
Итак, при повреждении создается цепь последствий первичной альтерации плазмолеммы, которая включает:
1.Недостаточность натрий-калиевого насоса и функций ионных каналов;
2.Утрату физиологических трансмембранных ионных градиентов;
3.Избыточный входной ток натрия и воды в клетку;
4.Набухание клетки;
5.Избыточный входной ток кальция в клетку;
6.Активацию мембранных фосфолипаз;
7.Освобождение и превращения арахидоновой кислоты;
8.Нарушение локальной микроциркуляции;
9.Появление вокруг клетки липидных медиаторов воспаления.
Окисление арахидоновой кислоты наступает в ответ на любое повреждение клеточной мембраны или на рецепцию самых разных регуляторов — гормонов, нейромедиаторов и иммуноглобулинов.
Субстрат и ферменты, необходимые для этого, присущи практически всем клеткам и многим постклеточным структурам организма (крайне слабой продукцией эйкозаноидов отличаются эритроциты).[154]
В связи с такой универсальностью продукцию эйкозаноидов считают одним из наиболее древних типовых защитных стереотипов клеток.
Универсальная значимость этого механизма для развития самой различной патологии может быть проиллюстрирована хотя бы тем фактом, что самое популярное и наиболее широкое по спектру своего применения лекарство — аспирин — действует именно в качестве блокатора синтеза некоторых эйкозаноидов.
Эйкозаноиды не накапливаются в клетках, всегда синтезируются заново и представляют собой медиаторную систему острой клеточной реакции на повреждение. Они быстро инактивируются в системном кровотоке и поэтому действуют только на ту клетку, которая их образует, и ее соседей. Поскольку их эффект ограничен очагом, где они формируются, эйкозаноиды представляют собой аутокоиды или паракринные регуляторы. Рассмотрим основные этапы арахидонового каскада (С.Бергстрём, Б.Самуэльссон, Дж.Вейн, 1982).
При повреждении мембран происходит переход просеринэстеразы в активную серинэстеразу. Последняя мобилизует при участии кальция и метилтрансферазы фосфатидилсерин, который превращается в фосфатидилхолин. Фосфолипаза А2, стимулируемая особым активирующим белком (PLAP), освобождает из фосфатидилхолина арахидоновую кислоту. Последняя может также образоваться из диацилглицерина, формируемого из мембранных фосфолипидов ферментом фосфолипазой С. Фосфолипазы ингибируются глюкокортикоидными гормонами, с чем, отчасти, связан противовоспалительный эффект этих регуляторов.
Свободная арахидоновая кислота окисляется в двух альтернативных путях образования липидных медиаторов. Один из этих путей контролируется ферментом циклооксигеназой и приводит к образованию простаноидов, к которым принадлежат простагландины и тромбоксаны.
Циклооксигеназа блокируется салицилатами, например, аспирином, а также индометацином, ибупрофеном и другими нестероидными противовоспалительными агентами.
Другой путь осуществляется при участии фермента липооксигеназы и активирующего этот энзим мембранного белка FLAP. Он ведет к эйкозаполиеновым кислотам и лейкотриенам. Получены избирательные ингибиторы липооксигеназного пути арахидонового каскада, например зилевтон (рис.29).
Циклооксигеназный путь начинается с появления циклической эндоперекиси арахидоната — простагландина G2 (2 обозначает количество двойных связей в боковой цепи).
Затем формируется простагландин Н2 (PgH2), а из него — наиболее биологически активные PgD2, PgE2, PgF2α, а в эндотелии и гладкомышечных клетках сосудистой и бронхиальной стенки — также и циклический PgI2, известный как простациклин.
Включение в кольцо эндоперекисей с помощью фермента тромбоксансинтетазы дополнительного кислородного атома позволяет преобразовать PgH2 в тромбоксан А2 (ТхА2), что, главным образом, происходит в мегакариоцитах и тромбоцитах, а в эндотелии осуществляется менее активно. Другим медиатором этого ряда служит ТхВ2. образуемый из ТхА2.
Именно альтерация клеточных мембран — это тот великий пианист, который включает через клавиши липидных медиаторов тканевой ответ на повреждение (воспаление).
Патофизиологические эффекты простаноидов при местном ответе ткани на повреждение подробно охарактеризованы ниже в разделе «Воспаление». Поэтому, в данной главе необходимо остановиться на таких аспектах их действия, которые выходят за рамки собственно воспалительного процесса.
PgE2 известен как один из медиаторов, повышающих сосудистую проницаемость (вместе с PgD2) и расширяющих микрососуды (вместе с простациклином). При нормальном системном кровяном давлении это способствует улучшению местной перфузии. Подобный эффект делает упомянутые простаноиды [155] мощными стимуляторами кровоснабжения стенки,желудка. К тому же, они способствуют выделению защитной слизни снижают образование кислоты в желудке. Все это, в целом, обеспечивает им роль ключевых противоязвенных факторов и портит репутацию салицилатов таким серьезным побочным действием, как ульцерогенный эффект. Простагландин Е2 опосредует резорбцию костей и повинен, в частности, в гиперкальциемии и остеопорозе, наступающих при злокачественных новообразованиях. Простагландин Е2 выделяется под влиянием секретируемого опухолевыми клетками паратиреоидинподобного полипептида, а также при воздействии интерлейкина-1 и фактора некроза опухолей, производимых при онкологических заболеваниях клетками иммунной системы. Резорбция костей при ревматоидном артрите и альвеол при гингивитах тоже опосредована этим медиатором. Установлена стимулирующая роль PgE2 для секреции ренина, почечного кровотока, натрийуреза и диуреза и ингибирование им вазопрессин-зависимой реабсорбции воды. Нарушение этих механизмов может привести при избыточном действии PgE2 к гипокалиемическому выделительному алкалозу (синдром Барттера). Простаноиды, особенно, PgE2 и простациклин, способны ингибировать в островках Лангерганса секрецию инсулина в ответ на глюкозу, что, вероятно, имеет значение в патогенезе нарушений инсулиновой секреции при сахарном диабете. В то же время, в жировой ткани действие PgE2, тормозящего липолиз, и PgI2, стимулирующего распад жира, противоположно.
PgE2 и PgF2a стимулируют сокращения матки и инволюцию желтого тела, в связи с чем предполагают их участие в патогенезе дисменорреи и выкидышей. Последний, к [156] тому же, является вазоконстриктором и может нарушать кровоток в плаценте.
PgE2 опосредует эффекты эндогенных пирогенов в гипоталамусе и играет ключевую роль в развитии лихорадки. Он оказывает иммуносупрессирующий эффект на лимфоциты.
Баланс между ТхА2, выделяемым тромбоцитами, и простациклином, производимым эндотелием, определяет жидкое состояние крови в интактных сосудах и несмачиваемость неповрежденной сосудистой стенки, защищенной мономолекулярной фибриновой выстилкой. Интересно, что аспирин подавляет продукцию обоих этих регуляторов, однако эндотелий способен восстановить ферменты, генерирующие простациклин, значительно скорее, чем появятся новые тромбоциты, способные к выработке тромбоксана А2, в связи с чем результирующий эффект действия аспирина — антикоагулянтный и антитромбогенный. Простациклин тормозит формирование атером, его продукция стимулируется антиатерогенными липопротеидами высокой плотности.
Итак, эффекты простаноидов, появляющихся при повреждении клеточной мембраны, могут быть как защитными, так и повреждающими. К тому же, простаноиды способны стимулировать выделение из клетки других биорегуляторов, например дегрануляция тучных клеток может быть запущена через рецептор PgD2.
Обсуждая патогенные и защитные эффекты системы простаноидов, мы все время упоминаем одно из мощнейших лекарств, открытых человечеством — аспирин. Аспирин стал употребляться почти за столетие до того, как прояснили механизм его действия — блокирование циклооксигеназы.
Мы уже отмечали выше, что фармакологический эффект аспирина, так же как и наиболее серьезный из его побочных эффектов — ульцерогенный, базируются на одном и том же механизме.
На наш взгляд, это — принципиально важный факт: фармакология не может полностью отделить лечебный и побочный эффекты лекарства вследствие того, что в организме защитное и вредоносное действие неотделимы и порождаются одним и тем же механизмом. Остается только согласиться с образной трактовкой этого «принципа Мефистофеля», которую дал почти 200 лет назад творец «Фауста» доктор Иоганн-Вольфганг Гете:
... так кто ж ты, наконец ?Липооксигеназный путь приводит к образованию под действием фермента 5-липооксигеназы 5-гидропероксиэйкозатетраеновой кислоты (5-НРЕТЕ), а затем 5-гидроксиэйкозатетраеновой кислоты (5-НЕТЕ). Последим служит мощным хемоаттрактантом полиморфонуклеарных лейкоцитов. Из нее образуются лейкотриены (Lt) A4 и В4 (медиаторы краевого стояния лейкоцитов и адгезии тромбоцитов, а также хемоаттрактанты этих клеток). Присоединив пептид через сульфгидрильную группу, LtA4 переходит в кислые серосодержащие липопептиды LtC4, LtD4 и LtE4, ранее условно называвшиеся в патофизиологии «медленно реагирующая субстанция анафилаксии» — МРСА. Компоненты МРСА вызывают, соответственно, вазоспазм (С4), бронхоспазм (D4) и повышение проницаемости сосудов (Е4), что делает их ключевыми участниками коронарных ишемических приступов, бронхиальной астмы и отека Квинке, Наконец, LtF4 можно получить из LtE4 путем глутаминирования.
Часть силы той, что вечно хочет зла
И вечно совершает благо
Роль лейкотриенов особенно велика при бронхиальной астме и ишемической болезни сердца.
При астме лейкотриены вызывают не только бронхоспазм, но также и отек слизистой бронхов, нарушение мукоцилиарной функции и увеличение продукции бронхиальной слизи. Все это вместе обеспечивает обструкцию дыхательных путей. Лейкотриен В4 вместе с другими хемотактическими факторами обеспечивает аттракцию тромбоцитов, эозинофилов и других полиморфонуклеаров, которые при помощи своих медиаторов, в частности, [157] лейкотриена С4, поддерживают нарушения бронхиальной проводимости.
При ишемической болезни сердца, вопреки широко распространенному мнению, наивысший риск инфаркта миокарда и внезапной сердечной смерти, а также наиболее гласная нестабильная форма стенокардии связаны не с большими фиброзными и кальцинированными атеросклеротическими бляшками, а с относительно меньшими по размерам поражениями, богатыми липидами и макрофагами. Дело в том, что коронарная ишемия, особенно её вариантная форма (М.Принцметал и соавт., 1947) развивается не столько вследствие прямого анатомического сужения просвета венечного сосуда бляшкой, сколько вследствие спазмов коронаров, которые провоцируются выбросом лейкотриенов из нестабильных липидно-макрофагальных атером.
Спектр эйкозаноидов, производимых различными клетками в ответ на повреждение, сильно отличается. Он также может варьировать и для одних и тех же клеток в зависимости от условий, например, парциального напряжения кислорода или диеты и доступности субстратов. Так например, клетки сосудистой стенки боталлова протока после перехода к легочному дыханию у новорожденного из-за возрастания парциального напряжения кислорода в крови уменьшают продукцию простагландина Е2 и изменяют реакцию на него, следствием чего является закрытие боталлова протока (см. ниже раздел «Онтогенетические аспекты стресса»). Нейтрофилы уникальны своей способностью производить тригидроксиэйкозаноидные производные — липоксины.
Употребление в пищу смородины, некоторых сортов зеленых яблок и пищевой добавки тартразина, содержащейся в кондитерских изделиях, прохладительных напитках и мятных таблетках, особенно, на фоне пищевого дефицита ненасыщенных жирных кислот, может сместить равновесие продуктов арахидонового каскада и вызвать преобладание лейкотриенов над простагландинами. У лиц с конституциональной недостаточностью циклооксигеназы (синдром Видаля) это может вызвать бронхоспазм и астматический кашель, что [158] иногда ошибочно трактуется, как пищевая аллергия. Подобные же явления провоцируются у таких пациентов аспирином.
Дополняя диету ω-3 ненасыщенными жирными кислотами, содержащимися, в частности, в морепродуктах, можно добиться снижения продукции арахидоновых метаболитов с непредельными связями во 2 и 4 положении и увеличить выработку производных дигомоглиноленовой и эйкозапентаеновой кислот, с двойными связями в положении 3. Это приводит к уменьшению тромбогенных и агрегационных свойств тромбоцитов, формирующих ТхА3 вместо ТхА, и к увеличению тромбо- и спазморезистентности сосудистой стенки. Диеты, богатые ω -3-ненасыщенными жирными кислотами, рекомендуются в превентивной медицине для профилактики атеросклероза и его осложнений. Эйкозаноиды оказывают на те или иные функции клеток разнонаправленный эффект, в зависимости от их концентрации и от присутствия других сигналов. Это связано с их способностью модулировать ответ клеток на различные биорегуляторы путем вмешательства в механизмы пострецепторного опосредования. Они, например, влияют на клеточный ответ, изменяя скорость продукции цАМФ, через взаимодействия с G-белками (рис.30).
Цитоскелет — это система микротрубочек (диаметром 20-25 нм), промежуточных филаментов (диаметром 15 нм), а также тонких актиновых (6-8 нм) и толстых миозиновых (15 нм) филаментов (рис.31).
Элементы цитоскелета способны к самосборке и обратимой полимеризации и состоят из глобулярных и фибриллярных белков: тубулина, динеина и динамина (микротрубочки), актина, миозина (микрофиламенты), виментина, кератинов, десмина и других (промежуточные филаменты).
Они прикреплены к органоидам и к плазматической мембране через систему якорных белков (винкулин, аддуцин, анкирин, α- и β-спектрины, белок 4. 1) и связывают мембранные гликопротеины — гликофорин и уже знакомый нам, в качестве антигена стареющих клеток, белок третьей полосы.
Цитоскелет ответственен за поддержание формы клеток и за все способы их движения (деятельность ресничек, жгутиков, ундулирующих мембран и псевдоподий). Он же обеспечивает внутриклеточное перемещение органоидов и включений (например, гранул при дегрануляции тучных клеток или хромосом при митозе). Прикрепление клеток к межклеточному веществу и друг к другу и передачи сигнала от рецепторов плазматической мембраны внутрь клетки также проходит при участии этой внутриклеточной опорно-двигательной системы (рис.31). Г.Альбрехт-Бюлер (1985) указывает, что именно исследование цитоскелетной организации цитоплазмы переменило основную парадигму по отношению к. внутренней среде клетки. Если в XIX-м веке протоплазма воспринималась, как простое вместилище гигантского количества случайно распределённых специфических молекул, конкурирующих и взаимодействующих друг с другом, а в первой половине нашего столетия — как автоматическая машина, состоящая из мультиэнзимных комплексов, то познание механизмов, связанных с цитоскелетом, позволяет сейчас трактовать цитоплазму как своего рода жидкостно-кристаллический компьютер, обрабатывающий информацию то есть «интеллектуальный». В доказательство автор приводит поразительные данные, что треки спонтанной миграции сестринских клеток, после их деления на абсолютно гладкой поверхности с напылённым золотом в большинстве случаев строго зеркальны или идентичны (1977)! Это свидетельствует» том, что обработка пространственно-временной информации при участии цитоскелета «предопределяет» клеточную судьбу и является внутренней детерминантой поведения отдельно взятой клетки. Более того, получены подтверждения того факта, что цитоскелет позволяет клеткам оценивать топологические свойства поверхностей, безотносительно к химическим сигналам, обеспечивает координированную миграцию «косяков» клеток [159], а центриоль является главным пространственно-временным координатором в жизни клетки.
Вполне естественно, такие существенные для патофизиологии явления как фагоцитоз, пиноцитоз, хемотаксис — всецело связаны с функцией цитоскелета. (см. также ниже — раздел «Воспаление») Например, нарушение полимеризации микротрубочек цитоскелета лейкоцитов при аутосомно-рецессивном синдромe Чедиака-Хигаши ведет к задержке слияния фагосом с лизосомами в нейтрофилах и макрофагах и нарушению киллерного эффекта НК-лимфоцитов, вследствие чего пациенты с данным заболеванием страдают от частых и длительных инфекций, в основном, вызванных гноеродной флорой. У больных нарушается хемотаксис лейкоцитов и их выход из костного мозга и из сосудов. Во всех содержащих лизосомы клетках появляются гигантские лизосомальные гранулы. Имеется пародонтит. Позже могут развиваться симптомы лимфомы. Неврологические нарушения, сопровождающие этот синдром (нистагм, периферическая нейропатия, умственная отсталость) могут также быть связаны с дефектами цитоскелета нейронов. Бактерицидная эффективность фагоцитов при этом синдроме снижена, даже несмотря на компенсаторное возрастание интенсивности метаболического взрыва при фагоцитозе.
Сократительные системы цитоскелета совершают свою механическую работу за счет расщепления АТФ и ГТФ при участии актин-миозиновой (в микрофиламентах) или тубулин-динеиновой (в микротрубочках) скользящих систем. Работа цитоскелета — достаточно энергоемкий процесс, осуществляемый с большой эффективностью. Сперматозоид движется вперед к яйцеклетке со скоростью 5 сантиметров в час. Хотя эта цифра кажется небольшой, все познается в сравнении — если бы сперматозоид был величиной с человека, это соответствовало бы скорости, гораздо большей, чем у олимпийского чемпиона по плаванию. А ведь единственным движителем этой чудо-машины служит один жгутик, составленный из элементов цитоскелета! [160]
При энергодефиците в клетке работа цитоскелета существенно нарушается. Например, сахарный диабет, мешающий нормальному осуществлению энергетического метаболизма в инсулинозависимых клетках, сопровождается «синдромом ленивых фагоцитов», при котором замедлен хемотаксис и снижена фагоцитарная активность этих клеток. В результате больные диабетом страдают от иммунодефицита.
При глубокой тканевой гипоксии из-за дефицита макроэргических соединений происходит настоящий паралич цитоскелета. Подробнее этот вопрос рассматривается ниже в разделе «Интегральные механизмы повреждения клетки».
Повреждение клеток сопровождается некоторыми типовыми нарушениями со стороны цитоскелета.
Набухание клетки, происходящее в ходе ее повреждения, приводит к отсоединению плазматической мембраны от элементов цитоскелета, составляющих ее внутренний каркас.
Например, при острой ишемии миокарда сарколемма кардиомиоцитов отсоединяется от промежуточных филаментов, укрепляющих ее изнутри, что снижает механическую прочность клеток. Помимо внутриклеточной гипергидратации, в этом участвуют протеазы, активируемые избытком кальция в гипоксических клетках и разрушающие якорный белок промежуточных филаментов виментин.
При вирусном поражении клеток зачастую вирусы взаимодействуют именно со структурами цитоскелета. Например, оспенный вирус, реовирусы и респираторные синцитиальные вирусы способны вызывать разрыв виментиновых промежуточных миофибрилл, изменения тубулина микротрубочек и слияние клеток. Следствием действия этих вирусов может быть угнетение работы мукоцилиарного ресничного аппарата и подвижности фагоцитов, а также образование многоядерных гигантских клеток.
Так как вирусы содержат специфические рецепторы, распознающие белки цитоскелета, антиидиотипический иммунный ответ против вирусных антигенов может приводить к появлению антиидиотипических аутоантител копирующих способность вируса связывать элементы цитоскелета. Поэтому многие вирус-индуцированные процессы продолжаются как аутоиммунные и сопровождаются появлением антител, поражающих цитоскелет.
Характерным примером служит агрессивный хронический гепатит. Данное аутоиммунное заболевание провоцируется вирусной инфекцией, в частности, вирусом гепатита С Однако, его персистирующее волнообразное течение обусловлено появлением аутоантител против белков цитоскелета — актина и кератина. До того, как был открыт цитоскелет, подобные аутоантитела характеризовались в клинической литературе, как антитела против гладких мышц.
Аутоантитела к элементам цитоскелета сперматозоидов вызывают снижение их подвижности и могут быть причиной бесплодия Показано, что они могут присутствовать · цервикальной слизи у женщин при бесплодном браке. Интересным и важным с эпидемиологической точки зрения представляется установленный венесуэльскими учеными факт, что титр антиспермальных антител у женщин повышается при беспорядочных половых связях с различными партнерами, очевидно, вследствие иммунизации более широким кругом различных спермальных антигенов, которая наступает при таком стиле половой жизни.
Существуют токсины, избирательно поражающие цитоскелет. Цитохалазины вызывают деполимеризацию, а токсин бледной поганки фаллоидин — стойкую полимеризация» актина. Колхицин блокирует полимеризацию, а таксол — деполимеризацию микротрубочек.
Наиболее ранимым элементом цитоскелета во многих Случаях оказываются уже упоминавшиеся выше промежуточные филаменты, локализующие органоиды в цитоплазме и обеспечивающие связь между ними, ядерной и плазматической мембранами. Важное типовое изменение, которое наблюдается в клетках [161] под влиянием многих разнообразных причин — ото образование внутриклеточного гиалина — гомогенной прозрачной белковой массы, окрашиваемой в розовый цвет эозином. Недавно было установлено, что источником внутриклеточного гиалина в ряде случаев является агрегация промежуточных филаментов, содержащих белок прекератин, между собой. Подобная агрегация наблюдается при токсическом повреждении клеток (тельца Меллори или алкогольный гиалин при поражении печени у алкоголиков), при болезни Коновалова-Вильсона, когда гепатоциты поражаются избытком меди, при врожденном циррозе печени, тяжелом ожирении и сахарном диабете. Агрегации элементов цитоскелета способствует нарастание концентрации цитоплазматического кальция, характерное для повреждения клетки и активность цитоплазматического фермента трансглютаминазы, активируемой при гибели клетки и сшивающей белки.
Важным аспектом повреждения цитоскелета считается его трансформация в злокачественных клетках, под влиянием онкобелков. Один из онкобелков, вырабатываемых злокачественными клетками, способен вызывать необратимое фосфорилирование цитоскелетного белка винкулина, участвующего в прикреплении клеток к межклеточному веществу. Из-за этого злокачественные клетки легко отсоединяются от межклеточного вещества и покидают свои места. Это считается важным механизмом, составляющим основу их способности расселяться по организму — метастазировать.
Большая часть внутриклеточных мембран принадлежит к эндоплазматическому реткулюму. А.Д.Адо (1985) указывает на его обязательное участие в процессах клеточного повреждения. Различные факторы, включая отравления алкоголем, ДДТ, четыреххлористым углеродом, инфекцию, ионизирующее излучение, гипоксию вызывают набухание ретикулюма, изменение его конфигурации появление крупных вакуолей и петель или распад на мелкие гранулы. Например, при отравлении тротилом мембраны шероховатого эндоплазматического ретикулюма (ШЭР) в клетках печени приобретают вид характерных завитков.
При повреждении клеток в результате действия многих различных причин наступает такое типовое последствие, как отсоединение рибосом от мембран ШЭР. Теоретически, подобные изменения могут трактоваться, как защитные: в аварийной ситуаций клетка сокращает экспорт белка и стремится направить максимум белков на внутренние нужды. Но на деле это является одним из проявлений формирующегося в поврежденной клетке энергодефицита: фиксация рибосом к мембранам ШЭР, происходящая при участии белка рибофорина, является энергозависимым процессом.
Поэтому, дезорганизация ШЭР оборачивается для клетки серьезными нарушениями.
Транспорт вновь образованных белков нарушается и избыток их оказывается в цитоплазме, где они денатурируются по мере нарастания клеточной гипоксии и ацидоза и формируют картину «мутного набухания» или начальные стадии так называемой «зернистой дистрофии».
При повреждении клетки не остается в стороне от процесса и гладкий эндоплазматический ретикулюм (ГЭР).
Мембраны ГЭР являются отсеком клетки, содержащим систему мощных оксидаз со смешанной функцией. Эти ферменты содержат цитохром Р450 и являются железозависимыми. Они представляют собой дезинтоксикационную систему клетки. Оксидазы со смешанной функцией принимают участие в биотрансформации эндогенных соединений, в частности, инактивации сигнальных молекул, например, стероидных гормонов и обезвреживании билирубина. Трудно переоценить их роль в детоксикации ксенобиотиков, например, многих лекарств.
Р450-зависимые оксидазы — это система изоферментов, контролируемых генами, [162] которым присущ множественный аллелизм. В связи с этим, их активность подвержена значительной генетически детерминированной индивидуальной изменчивости и служит одной из главных биохимических составляющих конституции человека.
В 1966 году Д.У.Фосеттом и А.Л.Джонсом было установлено, что при интоксикациях ГЭР в клетках претерпевает гипертрофию. Примером может служить увеличение площади мембран ГЭР в гепатоцитах хомячков под воздействием фенобарбитала. Многие другие ксенобиотики, включая даже компоненты табачного дыма при курении, вызывают сходный ответ.
Функционально это явление сопровождается усилением антитоксической резистентности клеток и повышением скорости биотрансформации ксенобиотиков. Самое замечательное свойство этой реакции — ее неспецифический характер: индукция оксидаз с помощью фенобарбитала усиливает биотрансформацию и других лекарств и токсинов, в частности, ускоряется нейтрализация печенью стероидов и билирубина. Это явление учитывается клинической фармакологией при совместном назначении лекарств, а последнее обстоятельство даже используется в неонатологии для лечения фенобарбиталом гемолитической болезни новорожденных.
Однако, возможности системы оксидаз ГЭР небезграничны, кроме того ее работа порождает ряд нежелательных для клетки эффектов. Активация оксидаз ГЭР приводит к повышению продукции клеткой окиси азота. До известной степени, это благоприятно для ткани, в целом, так как способствует активизации микроциркуляции.
Но избыток NO ведет к ряду неблагоприятных результатов, частично описанных выше (блокирование цикла Кребса — см. раздел «Патология рецепции»).
При образовании окиси азота формируются, в качестве сопутствующих продуктов, свободные кислородные радикалы. Они способны причинять вторичные повреждения клеточным мембранам, нуклеиновым кислотам и другим компонентам клеток.
Так, при отравлении четыреххлористым углеродом оксидазные системы ГЭР вырабатывают стабильные альдегиды жирных кислот, повреждающие клеточные мембраны. Нейтрализация парацетомола Р450-зависимыми оксидазами гепатоцитов ведет к появлению эпоксидных и эноксидных соединений, обладающих мутагенной активностью. При небольшой скорости процессов емкость клеточных антиоксидантных систем, например, глутатиона, достаточна для нейтрализации потенциально опасных радикалов. Но массированный эффект может привести к вторичным повреждениям, происходящим вследствие самой работы защитной системы оксидаз со смешанной функцией.
Таким образом, и для эндоплазматического ретикулюма граница между защитным и патогенным результатом типового ответа на повреждение оказывается относительной. Основные звенья патогенеза повреждения внутриклеточных мембран представлены на рис.32.
Важной составной частью исполнительного аппарата клетки служит пластинчатый комплекс (комплекс Гольджи, описанный К.Гольджи в 1898г.). Этот органоид также представляет собой мембранную структуру, состоящую из стопок, в клетках млекопитающих содержащих каждая по 5-6 уплощенных ограниченных мембранами цистерн. В комплекс Гольджи поступают из ШЭР в специальных везикулах синтезированные там белки, снабженные углеводными остатками и предназначенные для распределения внутри клетки или экспортных нужд. Белки, подвергающиеся трансцитозу. вероятно, также не минуют комплекс Гольджи (М.Фаркухар, 1983).
Везикулы встраиваются в мембраны и передают свое содержимое в цис-цистерны аппарата, затем оно перекочевывает в медиальные цистерны и, наконец, в транс-цистерны. Комплекс представляет собой центральную [163] сортировочную, маркировочную и упаковочную станцию всех маршрутов внутриклеточного транспорта белков (Дж.Рагмэн, 1984). Ферменты комплекса подвергают белки кодирующему гликозилированию и фосфорилированию. Белки поступают в комплекс из ШЭР, имея стандартный остаток — «адрес» из 14 молекул гексоз (9 маннозилов, 2 ацетилглюкозамина и 3 остатка глюкозы). Если белок предназначен на экспорт, или в плазматическую мембрану — он теряет 6 маннозилов и глюкозу и приобретает вместо них адрес из двух симметричных тримеров ацетилглюкозамина (в медиальных цистернах), сиаловой кислоты и галактозы (в транс-цистернах). Если адрес белка — лизосома, то он теряет 1 маннозил и глюкозу и получает вместо них маркер из двух фосфатов (в цис-цистернах), что предохраняет его от дальнейших модификаций (Ю.Рот, Э.Бергер, 1982; К.Хиршберг, 1983). Аппарат Гольджи поражается при ряде приобретенных и наследственных расстройств. Так как он является местом образования и наполнения лизосом, часто его повреждение ассоциируется с лизосомальной патологией.
Наследственный дефект галакгозилтрансферазы комплекса Гольджи нарушает маркировку и, возможно, мешает доставке по назначению галактозилированных белков. При ряде лизосомальных болезней (см. выше характеристику муколипидоза 2 типа), именно неверная адресовка комплексом Гольджи готовых молекул гликозилированного фермента ведет к наследственному заболеванию. Наследственный аутосомно-рецессивный дефект маннозидазы приводит к маннозидозу — заболеванию, характеризующемуся нарушением отщепления маннозилов от белков в комплексе Гольджи. При этом происходит лизосомальное накопление олигосахаридов, что ведет к задержке психомоторного развития детей и дисплазии скелета, сопровождаемой помутнением прозрачных сред глаза, гепатеспленомегалией и патологической зернистостью нейтрофилов и лимфоцитов. Другой фермент комплекса Гольджи — ацетилглюкозаминтрансфераза — поражается при мукополисахаридозе3C (болезнь СанфилиппоС), имеющей тот же тип наследования и сходную с маннозидозом симптоматику. Лизосомные болезни подробнее охарактеризованы в отдельном разделе ниже.
Возможны и приобретенные нарушения работы «центрального клеточного вокзала». [164] Так, при везикулярном стоматите, его вирус, белок G которого обладает соответствующей маркировкой, «оккупирует» пластинчатый комплекс инфицированной клетки, заполняя его и нарушая транспорт других клеточных продуктов.
Не исключено нарушение процессов гликозилирования в аппарате Гольджи и при выраженной хронической гипергликемии, что может участвовать в патогенезе диабетических ангиопатий, в частности, способствуя отмечаемой задержке катаболизма мукополисахаридов и липопротеидов у таких больных.
При коллагенозах (а в низких титрах — и у здоровых индивидов) описаны аутоантитела к антигенам комплекса Гольджи.
Роль лизосом и пероксисом в механизмах повреждения клетки трудно переоценить. В 1892 году И.И.Мечников прозорливо заметил, что: «Primum movens воспалительной реакции есть пищеварительное действие протоплазмы, проявляемое относительно вредного деятеля» — и, фактически, предугадал открытие лизосом. Первооткрыватель этих органоидов Кристиан деДюв (1951) назвал лизосомы «стартовыми площадками воспаления». Ему же принадлежит образная характеристика лизосомы как «мешка самоубийства», подчеркивающая участие лизосом в аутолизе.
При повреждении клеток первичные лизосомы участвуют в процессе аутофагии, захватывая и переваривая своими гидролазами в составе аутофагосом остатки разрушающихся органоидов. Гетерофагия представляет собой составную часть фагоцитоза и пиноцитоза и состоит в образовании из эндосом и первичных лизосом фагоцитарных вакуолей (фагосом), где подвергаются разрушению захваченные при эндоцитозе объекты.
В фагосомах (аутофагосомах) действует и окислительный механизм разрушения объектов ауто- и гетерофагии, осуществляемый при участии активных кислородных радикалов — супероксидного аниона, синглетного кислорода, гидроксильного радикала и перекиси водорода. Одним из важных источников этих радикалов, наряду с ГЭР, митохондриями и цитоплазматическими ферментами служат оксидазы пероксисом, также участвующих в процессах происходящих в фагосоме и аутофагосоме.
Лизосомальная мембрана весьма стабильна и не повреждается даже при наличии в лизосоме агрессивных энзимов, радикалов кислой среды (рН в работающей лизосоме ; достигает 1.5-2 единиц). При обратимых повреждениях клетки, даже если они глубоки, пероксисомы и лизосомы не дают утечки агрессивного содержимого, несмотря на то, что в этих условиях может наблюдаться их значительное набухание.
Отсутствие сколько-нибудь значительных повреждений лизосом характерно для осуществления запрограммированной гибели клеток путем апоптоза. Однако гипоксия, ацидоз, радиация, голодание, избыток и недостаток витаминов А, Е и D, ряд ядов (например, эндотоксины бактерий тифо-паратифозной группы) и многие другие факторы увеличивают проницаемость лизосомальных мембран.
При глубоком необратимом повреждении, некробиотические изменения в клетке всегда приводят к разрушению лизосом, что вызывает аутолиз клетки, неизбежный при некрозе.
Ведущую роль в деструкции лизосом играет так называемый эндогенный детергентный эффект (см. ниже).
Еще основатель учения о некробиозе Д.С.Насонов отмечал, что при начальных степенях повреждения клеток краситель нейтраль-рот локализуется в них компактно, в виде гранул, а при глубоком повреждении — распределяется по цитоплазме диффузно.
В последующем было выяснено, что нейтральрот, как и многие слабые основания, избирательно накапливается в лизосомах в связи с кислой реакцией их содержимого, создавая впечатление «гранул». Диффузное его распределение соответствует этапу нарушения целостности лизосом.
Многие слабоосновные соединения избирательно накапливаются в лизосомах благодаря сходному феномену, названному А.А.Покровским [165] и В.А.Тутельяном «эффектом протонной ловушки».
Часть из них ингибирует лизосомальные ферменты. С этим связан противовоспалительный и противомалярийный эффект хлорамина и противоязвенное действие коррагинана.
Стабилизатором лизосомальных мембран служит антибиотик фосфамицин, в связи с чем он даже применяется для купирования нефротоксического действия других антибиотиков.
Некоторые лизосомотропные соединения дестабилизируют мембраны этих органелл и являются настоящими лизосомомембранотоксинами (термин введен Покровским и Тутепьяном). Их действие вызывает аутолиз и некроз клеток. Выработкой подобных токсинов отличаются некоторые грибки.
Желтый аспергилл (Aspergillus flavus) производит так называемые афлотоксины, соединения фурокумариновой природы. Отравление афлотоксином приводит к массивному некрозу печени и острой печеночной недостаточности. Механизм действия афлотоксина связан с резкой дестабилизацией этим ядом лизосомальных мембран в клетках печени и аутолизом гепатоцитов. Помимо этого, он нарушает транскрипцию и является гепатоканцерогеном.
Грибок Fusarium sporotrichiella выделяет токсин спорофузарин. Этот лизосомальный яд вызывает некроз клеток миндалин, сопровождаемый их отеком и воспалением (септическая ангина), а, попадая внутрь, провоцирует некротические изменения в костном мозге, приводящие к панцитопении апластического характера в периферической крови. Спорофузариновая интоксикация известна под названием «алиментарной токсической алейкии». Афлотоксикоз и алиментарная токсическая алейкия связаны с употреблением в пищу зараженного вышеназванными плесенями зерна.
Еще одна образная характеристика лизосом принадлежит Котрану и Кумару, назвавшим эти органеллы «мусорными корзинами клетки».
Неперевариваемые остатки липидных мембран объектов ауто- и гетерофагии сохраняются и подвергаются перекисному окислению во вторичных лизосомах, давая коричнево-желтый стабильный пигмент — липофусцин, накопление которого ассоциируется с процессами атрофии или отдаленными последствиями обратимого повреждения клеток. Этот пигмент накапливается с возрастом и маркирует процессы старения.
Помимо липофусцина в лизосомах фагоцитов могут сохраняться (и довольно долго) различные неметаболизируемые частицы. Описаны случаи, когда в фагоцитах мокроты у бывших шахтеров, тридцать и более лет не спускавшихся под землю, продолжали обнаруживаться частицы угля.
Так как срок жизни фагоцитов невелик, этот феномен свидетельствует о том, что объекты фагоцитоза персистируют внутри фагоцитов, передаваясь от одного их поколения другому путем фагоцитоза собственных стареющих или погибающих клеток.
Персистирование объектов фагоцитоза внутри вторичных лизосом возможно и для многих микроорганизмов. Такие микробы обладают веществами (например, дектинами), блокирующими слияние лизосом с фагосомами, или ингибиторами завершающей фазы фагоцитоза. Примером может служить возбудитель коклюша — бордетелла. Инфекции, вызванные такими возбудителями могут, подобно коклюшу, иметь затяжное течение или дают поздние рецидивы. Так, описаны рецидивы сыпного тифа через 50 и более лет после заболевания, в форме так называемой болезни Брилля, вызываемые активизацией риккетсий, персистировавших в макрофагах. Авторы Наблюдали случай болезни Брилля у пожилого пациента, который юношей — красноармейцем перенес сыпной тиф, сражаясь в Первой конной армии. Через пятьдесят лет с лишним повторились не только основные соматические симптомы болезни — даже содержание бредовых видений возвращало комсомольца двадцатых годов в эпоху Гражданской войны. [166]
Многие неорганические объекты фагоцитоза могут представлять для клетки бомбу замедленного действия, так как, попадая в лизосомы, не перевариваются, но могут сами разрушать эти органоиды изнутри. Таковы, например, двуокиси кремния и титана, алмазная пыль. Разрушая альвеолярные макрофаги, эти агенты способны запустить в легких хроническое воспаление с исходом в фиброз, что наблюдается при силикозе и близких к нему профессиональных заболеваниях.
Длительное персистирование антигенов внутри макрофагов, лизосомы которых не завершили фагоцитоз, создает условия для развития гиперергических реакций замедленного типа и формирования гранулем (см. ниже раздел «Аллергия»). Поэтому многие подобные инфекции (туберкулез, бруцеллез, сифилис) сопровождаются гранулематозным воспалением. Показано, что лизосомальные антигены могут быть объектом образования аутоантител, способствующих цитолизу.
При некоторых наследственных энзимопатиях лизосомы неспособны переварить те или иные субстраты (гликозаминогликаны, липиды или их комплексы, гликоген и др.). Подобные болезни характеризуются как тезаурисмозы или «болезни накопления», поскольку непереваренные субстраты образуют в лизосомах стойкие включения.
К лизосомальным болезням относятся болезни накопления липидов и гликолипидов (например, наследственные ганглиозидозы — болезнь Тея-Сакса и болезнь Зандхоффа, наследственный галактоцереброзидоз — болезнь Краббе, наследственный сфинголипидоз — болезнь Ниманна-Пика), мукополисахаридозы (например, болезни Сан-Филиппо А. В, С и D — гепарансульфатозы, болезнь Моркио—кератансульфатоз, болезнь Марото-Лами—дерматансульфатоз), гликогеноз 2 типа (болезнь Помпе или дефицит кислой мальтазы).
Клинические симптомы, как правило, касаются, главным образом, тех тканей, где в норме должен идти наиболее интенсивный лизосомальный гидролиз того или иного субстрата.
Общей чертой таких заболеваний нередко является нарушение психомоторного развития и иммунитета, потому что среди загруженных субстратами клеток оказываются нейроны и макрофаги. Поражение ЦНС наиболее характерно для липидозов и глико (муко) липидозов, так как компоненты миелина и клеточных рецепторов — цереброзиды, сфинголиниды и их комплексы с углеводами — наиболее широко представлены в нервной ткани.
В то же время, гликогеноз Помпе протекает без задержки психического развития, зато поражаются клетки, образующие гликоген, и имеет место миокардиодистрофия, миопатия и нарушение функций печени.
Цитологи до сих пор дискутируют, являются ли пероксисомы разновидностью лизосом или же самостоятельными древними домитохондриальными окислительными органеллами.
Пероксисомы выполняют в клетке ряд важных функций, включая образование и инактивацию перекиси водорода, окисление жирных кислот до ацетилкоэнзима А, окисление мочевой кислоты.
Наследственный дефект, связанный с отсутствием пероксисом, абсолютно смертелен и приводит к гибели новорожденных через несколько месяцев при явлениях иммунодефицита и гипоксии.
Пероксисомы обеспечивают кислородзависимый бактерицидный эффект при фагоцитозе. Во время повреждения клетки альтерация пероксисом способствует процессам образования свободных радикалов. Нарушение утилизации жирных кислот позволяет этим субстратам формировать в цитоплазме детергенты, что способствует омылению клетки и разрушению ее мембран.
При массовом разрушении клеток и их ядер, например, при синдроме длительного раздавливания, из пуриновых оснований в организме образуется значительное количество мочевой кислоты. Интенсивная работа уратоксидазы в пероксисомах приводит к освобождению значительного количества активных кислородных радикалов, что способствует вторичному повреждению клеток. Применение [167] в этих условиях блокаторов образования мочевой кислоты, например, аллопуринола, облегчает течение травматического синдрома.
Существуют классические крылатые фразы, известные каждому студенту-медику. В связи со своей общеизвестностью, их содержание служит большим подспорьем на экзаменах. Так например, даже при почти полном отсутствии знаний по цитологии, на банальный вопрос «Что такое митохондрии?» студент, как правило дает яркий и образный ответ: «Митохондрии — это энергетические станции клетки!».
Органоиды, о которых идет речь, замечательны во многих отношениях. Используя различные субстраты биологического окисления, митохондрии ведут окислительное фосфорилирование и вырабатывают АТФ. Это — заключительный этап катаболизма.
Катаболизм — трехступенчатый процесс, каждый из этапов приводит к освобождению определенной энергии, которая частично рассеивается в виде тепла сразу. Данная компонента носит название первично рассеянного тепла и непосредственно идет на нагрев тела и, следовательно, сразу входит в тепловые потери организма.
Первый, гидролитический этап катаболизма проходит в желудочно-кишечном тракте и в лизосомах без участия кислорода и освобождает до 1% всей энергии субстратов. Эта энергия полностью входит в первично рассеянное тепло и не запасается. Второй этап — бескислородного цитоплазматического расщепления — представлен в клетках гликолизом (Э.Бюхнер, 1907, O.Мейергоф, 1923) и аналогичными процессами распада липидов, приводящими к получению универсального катаболита — активного двууглеродного фрагмента ацетил-коэнзима А (Ф.А.Липман, 1953). Это приводит к освобождению не менее 30% всего теплосодержания субстратов, при этом запасается около 45%, а остальная часть тоже первично рассеивается.
Все клетки организма, за исключением эритроцитов (почти не имеющих митохондрий) и некоторых других клеток, описанных ниже, в той или иной мере проявляют способность подавлять анаэробный распад глюкозы и активировать аэробное митохондриальное окисление в условиях доступности кислорода при исправных митохондриях (эффект Пастера). Продукты второго этапа катаболизма, вовлекаясь в митохондриальное окисление, освобождают до 70% всей своей химической энергии и распадаются до конечных метаболитов — для углеводов и простых липидов это будут углекислый газ и вода (X.А.Кребс, 1937). Данный, наиболее эффективный этап катаболизма, может, в зависимости от регулируемой степени сопряжения окисления и фосфорилирования, приводить к запасанию в виде макроэргических соединений значительной части энергии — до 55% (686 000 калорий энергии освобождаемых при полном окислении 1 моля глюкозы дают возможность синтезировать до 38 молей АТФ), однако и здесь значительная часть энергии сразу рассеивается, прямо входя в основной обмен.
Некоторые онкобелки — продукты онкогенов, могут подавлять эффект Пастера, снижая активность глицерофосфокиназы в малигнизированных клетках и способность глицерофосфатного челнока переносить в митохондрии восстановительные эквиваленты. При этом метаболизм злокачественных клеток становится более гликолитическим, а, как следствие, снижается эффективность расхода глюкозы и генерируются кислые продукты гликолиза. Надо отметить, что в большинстве случаев аэробные процессы внутри опухолевых клеток при этом не прекращаются. В митохондриях лейкозных бластов присутствует аномальная РНК в виде открытых кольцеобразных или цепочечных структур — катенанов.
Сходными особенностями обладает энергетический обмен эмбриональных клеток, где также экспрессируются онкогены.
В нормальных условиях, попадая в митохондрии, ацетилкоэнзим А, скелет которого [168] состоит из атомов углерода, кислорода и водорода, теряет все свои водородные атомы в результате вовлечения в реакции цикла трикарбоновых кислот. Оставшиеся углерод и кислород формируют один из продуктов дыхания — СО2 Водородные атомы должны окислиться и сформировать второй продукт — воду.
Пространство между наружной и внутренней мембраной митохондрий представляет собой самый «кислый» отсек клетки из-за крайне высокой концентрации протонов. Внутренняя митохондриальная мембрана уникальна из-за высокого (до 75%) содержания гидрофобных белков и диглицерофосфатида кардиолипина. Она наиболее гидрофобна из всех мембран клетки — относительно непроницаема для гидрофильных веществ, анионов и катионов (за исключением кальция и, по некоторым данным, железа). Эта мембрана, пока она цела, непреодолима, в том числе, для катионов водорода, которые не могут форсировать ее иначе, как с помощью специальных переносчиков. Но если протоны велики по размерам и гидрофильны, то электроны из состава атомов водорода с легкостью форсируют внутримитохондриальную мембрану и попадают в дыхательную цепь — ансамбль окислительно-восстановительных ферментов, расположенных внутри митохондрий, открытых в 20-40-е годы нашего века (О.Варбург, 1931, А.Сент-Дьёрдьи, 1937).
Эти ферменты (HADH-дегидрогеназный комплекс, включающий флавопротеиновые дегидрогеназы и убихинон, цитохромный комплекс (в-cl), словно эстафетная команда, передают электроны друг другу, а в конце цепи цитохромоксидаза (цитохромы а-а3) снабжает лишним электроном кислород. Так как направленный поток заряженных частиц — это электричество, мы приходим к парадоксальному заключению, что тканевое дыхание в наших клетках — не что иное, как слабый электроток!
Вследствие накопления протонов в межмембранном пространстве митохондрии, по мере сжигания субстратов в цикле трикарбоновых кислот между двумя сторонами внутренней митохондриальной мембраны появляется разность протоновых потенциалов. Это позволяет уподобить митохондрию конденсатору, заряжаемому с помощью окисления субстратов и имеющему заряд порядка 180мВ со знаком минус в матриксе (П.Д.Митчелл 1961-1966, В.П.Скулачёв, Е.С.Либерман, 1975).
Чем больше ацетилкоэнзима вовлекается в цикл трикарбоновых кислот, тем выше протоновый потенциал митохондриального «конденсатора».
Трансмембранный ферментативный комплекс — протон-транслоцирующая АТФ-аза или Н+АТФ-синтаза, состоящий из двух компонентов — F1 (фактор Рэкера, локализованный в головках грибовидных телец и обладающий АТФ-азной активностью) и F0 (имеющий мембранную локализацию и придающий комплексу АТФ-синтазную активность). F1-F0 комплекс формирует протоновые ворота, а протоны, проходя через них, передают свою энергию АТФ-синтазе, вырабатывающей АТФ.
Если устранить фактор Рэкера или разобщить F1 с F0, окисление будет продолжаться, но поток протонов не будет генерировать АТФ. Разобщение окисления и фосфорилирования приведет к увеличению свободного первичного рассеивания тепловой энергии и снижению коэффициента полезного действия митохондрий. Срочная мобилизация теплоты, сопровождаемая повышением интенсивности свободного окисления, может увеличить температуру тела, что используется при адаптации к гипотермии, пробуждении от зимней спячки и т.д. и контролируется гормонами щитовидной железы и, отчасти, надпочечников. Напротив, инсулин и эндогенные опиоиды, в частности динорфины при зимней спячке и β-эндорфин — при выходе из стресса способствуют уменьшению первичного рассеивания тепла и максимально эффективному фосфорилированию.
Ряд токсинов способен разобщать окисление и фосфорилирование, вызывая эндогенную гипертермию, относительную гипоксию и энергодефицит. Таковы, например динитрофенол [169] и дициклогексилкарбодиимид. Первый производит своего рода «пробой» митохондриального конденсатора, так как, будучи липофильным соединением, встраивается во внутримитохондриальную мембрану и создает утечку протонов и снижение протонового градиента, а также подавляет эффект Пастера. Мишенью действия второго служит специальный протеолипид, входящий в состав F0-компонента АТФ-синтазы, Под воздействием этого токсина перенос протонов и синтез АТФ прекращаются. Фосфорилирующая активность митохондриальной АТФ-синтазы ингибируется также антибиотиком олигомицином.
Таким образом, часть энергии катаболизма запасается митохондриями в виде двух взаимопревращаемых форм — разности потенциалов (например, протонового потенциала внутренней митохондриальной мембраны) и макроэргических фосфатных связей. Эта энергия может передаваться, в частности, при фосфорилирующей активации тех или иных белков-участников метаболизма или при распространении потенциалов вдоль проводящих структур.
Помимо окислительного фосфорилирования, митохондрии участвуют в окислении жирных кислот и в синтезе стероидов. Работа митохондриальных ферментов требует значительных концентраций кальция, который накапливается в митохондриях благодаря функции энергозависимого кальциевого транспортера. Митохондриальное накопление кальция существенно для процессов обызвествления тканей, включая окостенение хряща.
Данные органоиды способны накапливать и некоторые другие вещества, в частности, лецитин (в яйцеклетке) и токсины (в гепатоцитах и эпителии канальцев почек).
Затраты энергии, резервируемой митохондриями, необходимы клетке для поддержания жизнедеятельности, то есть выполнения всех видов полезной работы, а именно:
а)Механической — как это происходит при сокращении мышц или цитоскелета (А.В.Хилл, 1922)
б)Осмотической, как это происходит при создании и поддержании градиентов ионов, скажем: избытка кальция в митохондриях
в)Электрической — как это достигается при генерации потенциалов действия (А.Л.Ходжкин, А.С.Хаксли, 1963)
Несмотря на относительно высокую эффективность биосистем (так, к.п.д. здорового сердца приближается к 43% по сравнению с 3-6% у паровой машины), организм подчиняется началам термодинамики и не создает негэнтропию из ничего. Поэтому, при любом виде работы большая часть освобождаемой энергии превращается во вторичную теплоту. Это дает еще одну важную составляющую тепловых потерь организме.
Рассмотрим, вначале, приобретенные повреждения митохондрий. Выше уже шла речь о разобщении окисления и фосфорилирования под действием ряда ядов. Фармакологические дозы гормонов щитовидной железы также способны разобщать окисление и фосфорилирование/Но в организме, даже при тиреотоксических кризах, такие дозы не достигаются. Гипертермия и относительная гипоксия при тиреотоксикозе связана с активирующим действием гормонов щитовидной железы на работу основного потребителя АТФ, присутствующего в каждой клетке и утилизующего, как уже отмечалось выше, не менее 30% ее энергии — калий-натриевого насоса.
При многих клеточных повреждениях окисление в митохондриях тормозится.
Если прекратится окисление в цикле трикарбоновых кислот, отсутствие возобновления протонового градиента приведет к прекращению выработки АТФ.
Если в цепи биологического окисления образуются разрывы из-за нехватки каких-либо коферментов или ингибирования энзимов — это также остановит работу митохондриального генератора. В обоих случаях возникает невозможность утилизации кислорода, несмотря на его поставку — то есть тканевая гипоксия. В связи с большой важностью этого процесса при любых повреждениях клетки, ниже он будет рассмотрен детально. [170]
Примером остановки цикла трикарбоновых кислот могут служить тканевая гипоксия при отравлении аконитом, а также экзогенном или эндогенном отравлении аммиаком.
Нейтрализация аммиака в месте его максимального образования (нейронах) происходит путем связывания с кетокислотами и образования аминокислот и их амидов. Глутаминовая кислота и ее амид — глутамин транспортируются далее в печень, где аммиак переходит в мочевину, а α-кетоглутаровая кислота освобождается и рециркулирует. Нарушения выработки мочевины в печени приводят к связыванию аммиаком трикарбоновых кислот и прогрессирующей тканевой гипоксии ЦНС, которая проявляется комой.
Разрывы в цепи биологического окисления могут быть вызваны авитаминозами по витаминам В2, РР, Q, входящим в митохондриальные окислительно-восстановительные комплексы. К таким же последствиям приводит дефицит микроэлементов (в первую очередь, железа и меди). Не случайно, авитаминозы по витаминам-коферментам биоокисления и дефицит указанных микроэлементов имеют ряд общих симптомов, например, генерализованное поражение слизистых и кожи, эпителий которых является в норме высокоаэробной тканью.
Отравления мочевиной, фторотаном, сероводородом и сульфитами также протекают с ингибированием тканевого дыхания. Классический яд детективов — цианистый калий — эффективно блокирует систему цитохромов, вызывая картину острой тканевой гипоксии, прежде всего, в миокарде (что вызывает синдром стенокардии) и мозге (что проявляется потерей сознания и остановкой дыхания).
Активный гликолиз защищает клетку при гипоксии, оттягивая наступление фатального дефицита АТФ. Поэтому, когда коварные преступники используют для доставки цианидов в организм жертв сладости, это снижает эффективность яда. Хрестоматийным судебно-медицинским примером считается неудачная попытка заговорщиков отравить Г.А.Распутина с помощью сладких пирожных, содержавших цианистый калий.
К сожалению, как это будет показано далее в разделе «Механизмы гипоксического некробиоза», одним из факторов, нарушающих нормальную работу митохондрий, может служить сам дефицит кислорода. Это происходит, если кислород не поступает в клетку в течение более или менее длительного времени (3-5 минут для нейронов, 20-180 минут для миокарда или много часов — для фибробластов). Так как нехватка кислорода ломает митохондрии, все виды гипоксии имеют парадоксальную и опасную тенденцию — переходить в тканевую форму. Гипоксия может начаться, как циркуляторная (например, при тромбозе коронаров). Однако, через несколько десятков минут она становится тканевой.
При прогрессирующей тканевой гипоксии во время повреждения и разрушения клетки митохондрии претерпевают некоторые стадийные типовые изменения. При достаточно глубокой, но обратимой гипоксии они набухают и вакуолизируются·. Происходит увеличение этих органоидов, кристы сглаживаются, а на мембранах появляются складки. Затем в митохондриях могут обнаруживаться небольшие тельца, являющиеся скоплениями денатурированных липопротеидов. При необратимых изменениях в составе этих телец накапливается кальций, возрастает их размер и плотность. Прогрессирующее набухание придает митохондриям гигантский размер и странную форму. Процесс заканчивается разрывом митохондриальных мембран и кальцификацией остатков этих органоидов, что уже относится к посмертному некротическому распаду клетки. Митохондрии набухают при длительной гипоксии вследствие того, что при дефиците энергии они неспособны удержать кальций, и он обменивается на калий, фосфат и воду.
Набухание митохондрий может происходить из-за пассивного увеличения проницаемости внутренней мембраны для всех ионов при отсутствии тканевого дыхания. Так действуют [171] на митохондрии ядовитые тяжелые металлы. В этом случае вода входит в матрикс митохондрий вслед за катионами калия и натрия и анионом хлора. Активное набухание митохондрий наблюдается при частично сохранном трансмембранном потенциале и повреждении внутренней мембраны {гипоксия, активация митохондриальной фосфолипазы, свободнорадикальные процессы). При этом калий входит в матрикс митохондрии, уравнивая разность потенциалов. Вслед за ним переносится фосфат и по осмотическому градиенту — вода. (Ю.А.Владимиров, 1994).
Набухшие митохондрии уже не будут нормально усваивать кислород, даже если лечение устранило первичную причину гипоксии (например, циркуляторные нарушения в миокарде при инфаркте). Если не принять этого во внимание и не лечить любую длительную гипоксию, как тканевую, то после устранения причины гипоксии (например, спазма сосудов или тромба) некробиотический процесс в пораженных клетках будет продолжаться.
Таким образом, набухание митохондрий при глубокой гипоксии вносит существенный вклад в придание кислородному голоданию необратимого характера. Другая важная причина, делающая глубокую гипоксию необратимой, это эндогенный детергентный эффект, вызванный отсутствием утилизации жирных кислот в поврежденных митохондриях. Нарушение митохондриальной утилизации жирных кислот в кардиомиоцитах типично для дифтерийного миокардита. Кардиомиоциты при дифтерии претерпевают жировую трансформацию с накоплением в клетках липосом. Жировая трансформация миокарда при дифтерии — особая разновидность некробиоза. Она обусловлена действием дифтерийного экзотоксина, который блокирует функции карнитинового челнока, транспортирующего ацилы длинноцепочечных жирных кислот в митохондрии. Вследствие этого в миокарде имеется энергодефицит, что проявляется задержкой его проводимости и снижением сократимости.
Неиспользованные ацилы жирных кислот оказывают мылоподобный эффект, способствуя разрушению клетки.
Освобождение кальция из поврежденных митохондрий также запускает механизмы дальнейшей деструкции клетки, поскольку избыток цитоплазматического кальция ускоряет и провоцирует апоптоз и некроз. Процесс некробиоза при гипоксии клетки рассматривается также далее, в специальном разделе. Важным агентом, повреждающим митохондрии, могут быть активные кислородные радикалы, образуемые при некоторых условиях в самих митохондриях. Они, в частности, способны блокировать сульфгидрильные группы кальциевой АТФ-азы и нарушать секвестрацию кальция в митохондриях.
Согласно наблюдениям Д.Уоллеса (1997), переедание и избыток субстратов вызывают в митохондриях усиление образования свободных электронов и активных радикалов, повреждающих эти органоиды и нарушающих усвоение энергетических эквивалентов. Автор связывает известный эффект удлинения жизни у крыс при пониженной калорийности питания с протекцией митохондрий от действия активных кислородных радикалов при малокалорийной диете. По мнению К.Дейвиса, митохондриальная ДНК в наименьшей мере защищена от соматических мутаций, так как в этих органоидах мала активность репаразной системы и высока скорость продукции активных кислородных радикалов (1992). В связи с этими наблюдениями, многие старческие заболевания — болезнь Альцгеймера, некоторые формы болезни Паркинсона и инсулиннезависимого сахарного диабета — связывают с окислительно-мутационным повреждением рассматриваемых в данной главе органоидов.
Свободнорадикальный аспект патологии клетки ниже подробно освещен в разделе «Механизмы свободнорадикального некробиоза».
Заканчивая обсуждать приобретенные митохондриальные нарушения, отметим, что антигены митохондрий нередко подвергаются повреждению в результате аутоиммунной атаки. [172]
Антимитохондриальные аутоантитела обнаружены, в частности, у больных в позднем периоде инфаркта миокарда. Предполагают, что в ходе некробиоза и некроза происходит аутосенсибилизация митохондриальными антигенами. Показано, что антимитохондриальные сыворотки могут быть цитотоксичны для клеток. В связи с этим) считается, что антимитохондриальные аутоантитела при инфаркте вносят патогенетический вклад в развитие постинфарктного диффузного кардиосклероза и аутоиммунного постинфарктного синдрома, Дресслера. Антимитохондриальные аутоантитела наблюдаются при системных заболеваниях соединительной ткани. Для первичного билиарного «цирроза» печени (изолированного или сочетающегося с подобными заболеваниями) наличие именно этих аутоантител типично и считается диагностически важным. Дело в том, что, в отличие от иных форм цирроза, при первичном билиарном аутоантитела к пируват-дегидрогеназе присутствуют у 95 больных из 100.
Изменения условий энергетического обмена быстро сказываются на состоянии митохондрий, которые очень динамичны и обновляются путем деления, имея собственную кольцевую двуспиральную ДНК. Это происходит примерно каждые 10 суток. Митохондриальные гены кодируют собственные транспортные и рибосомальные РНК, а также 13 из более чем 60 полипептидов, входящих в состав митохондриальных ферментов. Остальные закодированы в ядре.
Мутации ядерных и местных генов, контролирующих митохондриальные белки, как правило, не смертельны для клеток, которые способны выживать, переходя к анаэробному метаболизму. Однако, в тканях с высокой потребностью в кислороде (мышечная, нервная) при этом возникают клинически значимые нарушения, кроме того, вследствие усиленного гликолиза формируется метаболический ацидоз. Эти нарушения описаны у человека, как группа «митохондриальных болезней». Существуют митохондриальные болезни с нарушением транспорта субстратов в митохондрии (дефицит карнитина), запасания АТФ (дефицит АТФазы), дефектами дыхательной цепи (дефицит цитохромов).
Дж.М.Ленд и Дж.М.Кларк предложили следующую классификацию митохондриальных болезней (1979, модифицировано):
А)С нарушением утилизации субстратов
1.дефицит карнитина
2.дефицит карнитин-пальмитоилтрансферазы
3.дефицит пируватоксидазы
Б)С нарушением систем транспорта электронов и консервации энергии
1.синдром Люфта
2.нарушение НАДН-окисления
3.дефицит сукцинилдегидрогеназы
4.дефицит цитохромаb
5.дефицит цитохромас
6.дефицит цитохромоксидазы аа3
7.дефицит митохондриальной АТФ-азы
Характерные повреждения митохондрий при этих болезнях придают мышечным волокнам изорванный вид. Органоиды увеличены, содержат кристаллические включения и кристы искаженной формы. При специальной гистологической окраске скопления митохондрий приобретают красный цвет, вследствие чего мышечные волокна при митохондриальных болезнях описывают в патологической литературе, как «красные изорванные волокна». Характерно компенсаторов увеличение количества митохондрий в клетках.
У человека митохондриальные болезни нередко наследуются цитоплазматически по материнской линии через яйцеклетки. Они могут проявляться в самом разном возрасте — от младенчества, до старости.
Как правило, наследственные митохондриопатии выражаются в поражении головного мозга и мышц. При дефиците цитохрома С или пируватдегидрогеназы преобладают явления подострой некротической энцефалопатии (синдром Лея): развиваются симметричные некрозы в головном и спинном мозге что ведет к атаксии, судорогам, задержке умственного развития и гипотонии. Имеется [173] метаболический ацидоз с накоплением в мозге лактата и пирувата. Это обуславливает рвоту Другие формы дефицита цитохромоксидазы проявляются миопатией (слабость мышц, утомляемость, миоглобинурия, судороги при симметричном вовлечении, преимущественно, проксимальных мышечных групп) и дыхательной недостаточностью. Поражаются и высокоэнергоемкие процессы реабсорбции в почечных канальцах (развивается сопутствующий синдром ДеТони-Дебре-Фанкони). Болезнь имеет ядерное аутосомно-рецессивное наследование.
При синдроме Кирнса-Сэйра (дефицит карнитина) митохондриальная миопатия приводит к параличу взора и стойкому птозу век. Это может сопровождаться пигментной дегенерацией сетчатки, блокадой проведения в миокарде, глухотой, атаксией, деменцией, гипофункцией ряда эндокринных желез. В отсутствие карнитина митохондрии не могут нормально усваивать неэтерифицированные жирные кислоты, что необходимо для энергообеспечения при длительных усилиях. Болезнь не носит семейного характера, так как вызвана соматической мутацией на ранней стадии развития оплодотворенной яйцеклетки.
При дефекте митохондриальной лизил-тРНК возникает синдром MERRF (миопатия, миоклонус, судороги, глухота, задержка психомоторного развития). Дефект митохондриальной лейцил-тРНК проявляется синдромом MELAS (миопатия, энцефалопатия, лактат-ацидоз, инсультоподобные приступы).
Сравнительно более мягкими последствиями отличается дефицит сукцинилдегидрогеназы, наследуемый аутосомно-рецессивно через ядерный геном. У больных развивается интолерантность к физической нагрузке, варьирующая от одышки и сердцебиения — при умеренных, и до рабдомиолиза — при тяжелых усилиях.
Синдром Люфта, описанный у нескольких близких родственников в Иордании, характеризуется резким увеличением основного обмена (140-214% от нормы), гипертермией, усиленным рассеянием энергии и резко повышенной активностью митохондриальной АТФ-азы, при этом окисление и фосфорилирование сопрягаются недостаточно.
Роль митохондрий в процессе повреждения клеток огромна. Их деструкция является решающим событием при смерти клетки от гипоксии.